發酵對酸肉蛋白質降解及酸鮮品質特征的影響

劉肖，韋誠，周才瓊,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

酸肉是以新鮮豬肉為原料，添加適量米粉和鹽經厭氧發酵而成的一種傳統的地方美食，主要分布在西南和中南地區，特別是少數民族以及漢族和少數民族混居地區。作為一種傳統的豬肉保藏手段，這種厭氧發酵產酸所引發的變化，構成了酸肉特有的品質特點。特別是乳酸菌通過發酵產酸和細菌素，可改善產品的色澤、風味，并加快產品成熟[1]。由于酸肉是民間通過發酵的方式來保藏肉食品的一種方法，在發酵產酸后開始食用直到食用完畢，持續時間多達半年以上，期間以持續發酵的方式來保藏，這使酸肉長時間處于一定微生物和酸的條件下而成為一個動態體系，其持續的變化可能會影響酸肉品質。

蛋白質是肉制品的重要組成成分，其在加工和貯藏中的變化對肉制品品質起著關鍵性的作用，發酵肉制品的蛋白質降解與肉內源蛋白酶和發酵中微生物胞外酶等共同作用有關。微生物產酸導致內源酸性蛋白酶活性增加及微生物胞外酶產生等因素導致蛋白質降解[2-3]，生成一些多肽、小肽、氨基酸、醛、有機酸和胺類等物質，參與風味和質地的形成[4]，也是鮮味和酸味重要的特征構成成分。蛋白質降解產生的肽(特別是可溶性肽)和游離氨基酸是發酵肉制品鮮美滋味品質的重要組成，游離氨基酸組成變化還影響產品的風味[5]。此外，有報道稱在肉制品發酵過程中，乳酸菌代謝產酸可促進蛋白質的降解[6]，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,CRL681)能降解肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，特別是對肌漿蛋白的水解作用較強[7]，米酒乳桿菌可分解蛋白質產生游離氨基酸，賦予產品特有的鮮酸味[8]。鑒于此，研究酸肉在長時間發酵保藏中蛋白質的降解及對酸鮮滋味品質的影響，可為引導酸肉的合理食用、合理保藏提供有關蛋白質降解基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮豬瘦肉(背最長肌)、湖北大米、加碘食鹽。大米炒至微黃后，粉碎后過20目篩。

1.2 主要試劑

H3BO3、NaOH、NaCl、MgO、KCl、三氯乙酸、乙醇、濃HCl、濃H2SO4、無水CuSO4、ZnSO4、茚三酮、亞鐵氰化鉀、草酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和乳酸等，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.3 主要儀器與設備

FA2004A電子天平,上海精天電子儀器有限公司；722型可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司；L8900全自動氨基酸分析儀,日本日立公司；凱氏定氮裝置,重慶北碚化學儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀,日本島津公司；XW-80A旋禍混合器,海門其林貝爾儀器制造有限公司等。

1.4 實驗方法

1.4.1 酸肉制備及處理

原料肉切塊，加調味料(加入質量分數為5%食鹽、10%米粉、香辛料等)→揉制裝壇→密封發酵→成品。即從超市購買新鮮豬瘦肉(背最長肌)，洗凈瀝干，切成約3 cm×5 cm×0.5 cm薄片，添加質量分數為10%米粉和5%食鹽，揉制均勻，裝壇，用新鮮粽葉壓緊塞住壇口，水密封，20～25 ℃發酵。分別在發酵第0、20、50、80、110、140、180 天取樣分析。

1.4.2 蛋白質降解指標分析

1.4.2.1 非蛋白氮(nonprotein nitrogen, NPN)[9]

刷掉附在酸肉表面的米粉并剔除可見脂肪和筋膜，稱取絞碎肉樣10 g于錐形瓶中，加入90 mL蒸餾水，室溫振搖40 min，過濾后取25 mL濾液，加入10% TCA溶液25 mL。再次過濾后取10 mL濾液消化。凱氏定氮法測定非蛋白氮含量。

1.4.2.2 氨肽氮(aminopeptide nitrogen, AAN)[9]

準確稱取5 g絞碎肉樣，加入25 mL蒸餾水勻漿2 min，定容至100 mL，4 ℃下10 000×g離心20 min，上清液過濾后加入質量分數為50%的三氯乙酸使其TCA最終質量濃度為 500 g/L，過濾除去蛋白沉淀，取濾液用茚三酮比色測定，以異亮氨酸標準液繪制標準曲線。

繪制標準曲線：準確吸取200 μg/mL異亮氨酸標準液0、0.5、1.0、1.5、2.5、3 mL分別置于25 mL的容量瓶中，分別加水稀釋至4 mL，分別加入磷酸鹽緩沖液(pH值為 8.04)和茚三酮溶液(20 g/L)各1 mL，搖勻，沸水浴15 min，取出，迅速冷卻至室溫，加水至標線，靜置15 min。570 nm測吸光值，以異亮氨酸的質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，經擬合得回歸方程：y=0.033 7x-0.032 6，R2=99.32。

1.4.2.3 TCA-可溶性肽(三氯乙酸-可溶性肽)

參考VISESSANGUAN[10]的方法。稱取3 g絞碎肉樣，加入27 mL冰冷的50 g/L TCA溶液，高速均質(10 000 r/min,2 min)后于4 ℃靜置1 h，然后采用高速冷凍離心機離心(12 100×g,15 min)，取上清液。TCA-可溶性肽含量測定采用雙縮脲法，以牛血清蛋白作標準曲線，結果用μmol tyrosine/g muscle表示。

1.4.2.4 游離氨基酸

參照張蘇平等的方法[11]并略作修改。準確稱量1.5 g肉樣置于50 mL離心管中，加入15 mL、0.02 mol/L稀HCl充分均質，超聲萃取5 min，隨后冷凍離心(5 000 r/min，4 ℃)10 min，收集上清液，剩余殘渣按相同條件重復操作1次，合并上清液，定容至50 mL。移取2 mL定容后的上清液，加入2 mL體積分數8%的磺基水楊酸溶液，再次離心(10 000 r/min，4 ℃)10 min，上清液經0.22 μm水相過濾膜過濾后，上機分析。分析條件：總時間53 min；分離柱(4.6 mm×60 mm)，洗脫液流速0.4 mL/min，柱溫70 ℃，柱壓11.627 MPa；反應柱流速(茚三酮及茚三酮緩沖液流速0.35 mL/min)，柱溫135 ℃，柱壓1.078 MPa。

1.4.3 有機酸含量的測定

參照CHEN等[12]的方法。準確稱取5 g肉樣，加入25 mL超純水8 000 r/min均質2 min，超聲萃取5min，10 000×g離心20 min，取上清液定容至50 mL。吸取1 mL提取液過0.22 μm水系膜，注入高效液相色譜儀。色譜條件：Kromasil C18柱(250 mm×46 mm);流動相,A相為甲醇，B相為0.05 mol/L K2HPO4(pH值為 2.8)，分流比為2∶98；柱溫為30 ℃，流速為0.6 mL/min，進樣量10 μL，檢測器波長214 nm，根據保留時間定性，峰面積外標法定量。

繪制標準曲線：配制混合母液(草酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸5 g/L，乳酸10 g/L)，用超純水將混合母液稀釋5倍得到混合有機酸標準工作液。再用超純水將混合標準工作液配制成一系列混合標準液(乳酸0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL；其他酸：0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)。然后按上述色譜條件上機分析，以質量濃度ρ(g/L)對峰面積Y作圖，得標準曲線回歸方程如表1。

表1 有機酸標準曲線回歸方程Table 1 Standard curve equations for various organic acids

1.4.4 乳酸菌計數

按照《GB 4789.35—2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》，MRS培養基，涂布法平板計數。

1.4.5 感官評價

參考湯海青等[13]的方法，略加修改。邀請12位經專業培訓的食品專業人員(6男、6女)，對不同發酵時段酸肉進行感官評價，包括色澤、香氣、質地、滋味(蒸熟)，采用10分制。感官總得分=20%色澤+20%組織形態+30%氣味+30%滋味，感官評分達到8分以上表示品質良好，可接受性高；6～7分表示尚可接受，低于5分表示不能接受。評分員在進行評價時不得相互交談，更換樣品時用純水漱口。評分標準見表2。

表2 酸肉感官評價標準表Table 2 Sensory evaluation standards for sour meat

1.5 數據處理

結果以平均值±標準差表示，采用Origin 8.6作圖，SPSS 22.0進行單因素方差分析和相關性分析。p<0.05表示顯著，p<0.01表示極顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵對酸肉蛋白質降解的影響

2.1.1 非蛋白氮和氨肽氮在發酵中的變化

結果如圖1所示，隨發酵時間的延長，NPN和AAN均快速增加后保持穩定。NPN含量在發酵至80 d時迅速增長(p<0.05)，由13.96 mg/g升至23.25 mg/g，繼續發酵后NPN含量增速放緩。AAN在整個發酵期間持續增加(p<0.05)，至110 d后上升趨緩。

圖1 非蛋白氮和氨肽氮在發酵中的變化Fig.1 Changes of NPN and AAN during fermentation

NPN變化趨勢與馬艷梅等[14]報道的羊肉火腿加工中蛋白質降解趨勢相似，也和HU等[15]對鰱魚發酵香腸的研究結果類似。AAN和NPN的增加在一定程度上促進了酸肉風味的形成，與酸肉滋味密切相關。酸肉在整個發酵階段處于偏酸環境(pH值為4～5)，且自然發酵的優勢菌群為乳酸菌[16-17]。推測酸肉發酵中AAN含量的增加可能是乳酸菌等微生物胞外酶及乳酸菌產酸誘發酸性蛋白酶活性的提高，從而使AAN含量升高。

2.1.2 TCA-可溶性肽和游離氨基酸在發酵中的變化

現階段，我國社會主要矛盾為人民日益增長的美好生活需要和不平衡不充分的發展之間的矛盾。消費者的關注焦點也從簡單的溫飽問題轉移到了追求高品質的生活。我國質量信用建設雖取得了一定的發展，但整體來說還處于起步階段，體系還不夠完善，主要表現在：相關法律法規不健全，質量信用標準數量比較少，信用信息的收集發布機制仍不暢通，第三方產品質量信用評價市場還不活躍，適合各地經濟發展的統一規范的質量信用評價體系還不完善。

結果如圖2所示。發酵0 d時TCA-可溶性肽為67.80 μmol Tyr/g濕基，在0～110 d時隨發酵時間增加而逐漸增加(p<0.05)，隨后逐漸下降。表明發酵過程中蛋白質在逐漸降解，發酵后期的波動可能與蛋白質進一步水解有關。

圖2 TCA-可溶性肽和游離氨基酸在發酵中的變化Fig.2 Changes of TCA-soluble peptides and free amino acids during fermentation

TCA-可溶性肽是構成酸肉鮮味的重要品質成分，表明發酵可提升酸肉鮮味品質，合適的發酵時間是110 d。發酵110 d和180 d時，TCA-可溶性肽含量分別為發酵0 d時的1.9倍和1.57倍。該結果與曾雪峰[18]報道發酵酸魚TCA-可溶性肽含量比原料肉約增長了10倍有較大差距，也與戴夢婕等[19]報道發酵鰱魚糜TCA溶解肽含量持續增加不同，可能是由于原料肉特性及發酵條件差異造成。

隨著發酵時間的延長，游離氨基酸快速增加，在110 d后增長趨緩，發酵110 d和180 d時游離氨基酸總量分別為發酵0 d時的5.85倍和6.04倍。相關性分析顯示，游離氨基酸含量變化和AAN及NPN呈現極顯著相關性(p<0.01)。TCA-可溶性肽和游離氨基酸含量在發酵前期均呈逐漸增加的趨勢，至發酵110d時，TCA-可溶性肽有所下降，而游離氨基酸保持穩定，表明長時間發酵中主要是降低了可溶性肽的含量，進而影響酸肉鮮味品質。從游離氨基酸和可溶性肽變化趨勢看，發酵110 d左右酸肉品質較好。

2.2 游離氨基酸組成在發酵中變化

2.2.1 游離氨基酸組成變化

不同氨基酸呈現不同滋味特點，氨基酸的呈味與其側鏈R基團疏水性有關[20]，當氨基酸疏水性較小時，主要呈甜味，如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸和天冬酰胺等。當氨基酸疏水性較大時，主要呈苦味，如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸等；當側鏈R基團為酸性基團如—COOH、—SO3H時則以酸味為主，如天冬氨酸、谷氨酸，也是鮮味的重要物質。

游離氨基酸組成在發酵中的變化結果見表3。大部分游離氨基酸含量隨發酵時間延長呈升高的趨勢，峰值游離氨基酸濃度多出現在發酵110～180 d，其中，呈酸鮮滋味的天冬氨酸和谷氨酸峰值濃度在發酵110 d，可能是谷氨酰胺脫氨基作用，對酸鮮味形成有利[21]。呈甜鮮滋味的氨基酸包括絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸峰值散布在發酵110～180 d，丙氨酸的持續增加對形成酸肉甜味有促進作用[22]，呈苦味的氨基酸含量多數隨發酵時間延長逐漸增加。

表3 游離氨基酸在酸肉發酵中的變化(mg/100g濕基)Table 3 Changes of free amino acids in sour meat at different fermentation time

注：結果以均值±標準差表示，n=3，同一行數據不同字母表示顯著性差異(p<0.05)，下同。“*”表示主要呈苦味的氨基酸。“**”表示主要呈甜鮮味的氨基酸。“***”表示主要呈酸鮮味的氨基酸。

2.2.2 呈味游離氨基酸變化特點

各呈味游離氨基酸如圖4所示，主要呈酸鮮味感和甜鮮味感的氨基酸在發酵110 d時達峰值，呈苦味的氨基酸含量則隨發酵時間延長逐漸增加，表明長時間發酵可能影響酸肉滋味品質，使酸、鮮、甜的滋味下降，苦味增加。

圖4 呈味游離氨基酸含量在發酵中的變化Fig.4 Changes of flavor free amino acids at different fermentation time

表4 呈味游離氨基酸味覺強度在發酵中的變化Table 4 Changes of the strength of tastes of flavor free amino acids at different fermentation time

注：味覺強度=味感物質濃度(%)/該味感物質閾值(%)[23]

2.3 發酵對酸肉中乳酸菌數及有機酸的影響

2.3.1 乳酸菌在酸肉發酵中的變化

酸肉中的乳酸菌在發酵過程中的變化情況如圖5所示。隨發酵進行，酸肉中乳酸菌快速增加，發酵50 d達峰值后保持穩定，發酵50 d和180 d時乳酸菌數分別為發酵0 d時的1.81倍和1.49倍。即在酸肉發酵中乳酸菌達到一定水平后會保持穩定，可能與乳酸菌自身產生的細菌素可對乳酸菌群數量消長進行調節有關[24]。

圖5 乳酸菌在酸肉發酵中的變化Fig.5 Change of lactic acid bacteria in sour pork during fermentation

2.3.2 發酵時長對酸肉中有機酸組成的影響

酸肉是通過乳酸菌厭氧發酵產酸抑制腐敗菌生長繁殖以保藏豬肉的一種傳統方法，這種發酵產生的有機酸的含量及組成是酸肉特征酸味的基礎。實驗結果如圖6和表5所示，檢出的有機酸包括草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸，未檢出乙酸。酒石酸本底值較高，在發酵中呈現先升后降的趨勢，占總有機酸組成比從發酵0 d時的81.24%逐漸降至發酵180 d時的57.46%，是酸肉主要的有機酸。乳酸則隨發酵時間延長逐漸增加至發酵80 d后保持穩定，乳酸含量占比從發酵0 d時的15.12%逐漸增至發酵180 d時的38.79%。該研究結果與王雪鋒等[25]報道酒石酸是臭鱖魚發酵中含量最高的有機酸相吻合。動物性食品含有較高的酒石酸，約在2%～3%[25-26]。發酵80d時酸肉總有機酸達峰值濃度，為5913.66 mg/100 g濕基，酒石酸和乳酸分別占比62.12%和29.37%。總有機酸含量較高，但酸肉pH值保持約4.2[16]，可能與不同有機酸酸度差異有關，酸肉中主要的酒石酸酸度僅相當于檸檬酸的0.68～0.71[23]。

圖6 發酵保藏過程中酸肉中的有機酸含量Fig.6 Content of organic acids in sour meat during fermentation preservation process 注：檸檬酸在50、80、110及180 d時未檢出，以平均數±SD作圖，不同大寫字母表示同種有機酸在不同發酵時間下含量在0.05水平上差異顯著；不同小寫字母表示相同發酵時間下不同種類有機 酸含量在0.05水平上差異顯著。

隨發酵進行，草酸、酒石酸及琥珀酸呈先增后降趨勢，峰值含量出現在發酵80～110 d。檸檬酸則在發酵20 d后含量降低或未檢出。有機酸含量的波動與發酵過程中微生物代謝活動密切相關，也會影響酸肉酸味特征，并對酸肉質地、觸覺、口感發生重要影響，并誘導肌球蛋白和膠原蛋白等改變[27]。經對各發酵時段有機酸味覺強度進行分析(表5)，琥珀酸、酒石酸和草酸味覺強度高值出現在發酵80～110 d，乳酸味覺強度高值出現在發酵80 ～180 d；總味感強度呈先升后降趨勢，高值出現在發酵80～110 d。發酵前期(<80 d)由于酒石酸本底值較高，酸味感主要受酒石酸影響。發酵80～110 d時，除檸檬酸外，各有機酸味感強度均達高值，此時酸肉的酸味感受受各種有機酸綜合作用，味感層次和強度均最強。繼續發酵乳酸味感強度占比增加,酸味感會變得尖利。

表5 酸肉發酵中有機酸味覺強度的變化Table 5 Changes of taste the strength of tastes of organic acids at different fermentation time

注：味覺強度=味感物質濃度(%)/該味感物質閾值(%)[23]。

2.4 發酵時長對酸肉感官品質的影響

結果見表6，發酵前50 d酸肉色澤得分呈升高趨勢，說明0～50 d是酸肉特有色澤形成階段，140 d后由于肉表面或局部色澤暗淡發黃導致得分降低，組織形態得分先增加，后期由于肉塊表面發糜和組織較松散得分降低，氣味和滋味得分先升高并在發酵80 d時得分最高，隨后明顯下降。由感官總得分結果可知，發酵20～140 d酸肉樣品均能被消費者接受，其中以發酵50～80 d接受度最高，20 d和110 d次之，140 d較差。至180 d時酸肉感官得分接近不可食得分，由此推測發酵140 d后酸肉品質開始劣變，這與蛋白質在微生物產酸影響下的持續降解有關。

表6 不同發酵階段酸肉的感官評價結果Table 6 Sensory evaluation of sour meat at different fermentation stages

酸肉發酵中感官品質、滋味氣味總評分與蛋白質降解相關成分進行相關性分析，結果見表7。

表7 感官品質與滋味相關指標的相關性分析Table 7 Correlation analysis of sensory and taste qualities

注：表中數據為Pearson相關系數。“**”表示在0.01水平(雙側)上顯著相關；“*”表示在0.05水平(雙側)上顯著相關。

酸肉感官品質、滋味氣味品質與谷氨酸、絲氨酸、氨基酸總味感強度和乳酸含量呈正相關(p>0.05)；感官品質與總有機酸呈正相關，其中滋味氣味與總有機酸含量顯著呈正相關(p<0.05)；酸肉感官品質及滋味氣味品質與酒石酸及總有機酸味感強度呈極顯著正相關(p<0.01)。表明酸肉品質受多種因素的影響，酸味總味感強度是影響酸肉品質最重要的因素，游離氨基酸中的谷氨酸是重要的鮮味構成成分。

3 結論

隨著發酵時間延長，NPN、AAN、TCA-可溶性肽和大部分游離氨基酸呈增加趨勢，說明酸肉發酵過程中，蛋白質降解在一定程度上可促進風味的形成和營養品質的提高，但隨著發酵時間的延長，TCA-可溶性肽含量有所下降，使酸肉鮮的品質下降，加上蛋白質持續降解可產生苦味氨基酸，可能會帶來不利影響。從TCA-可溶性肽變化趨勢看，酸肉采用發酵的方式保藏不宜超過110 d。

肉的滋味物質主要來源于蛋白質降解生成的肽及游離氨基酸，肽是鮮味的基礎，而游離氨基酸對產品滋味及風味有一定作用，不同氨基酸由于極性差異呈現出不同的風味。酸肉發酵中酸鮮、酸甜和苦味的氨基酸均呈增加的趨勢，其中，具有酸鮮和酸甜滋味的游離氨基酸高值出現在發酵110 d左右，繼續發酵則逐漸下降，而苦味氨基酸則呈持續增加的趨勢，從酸鮮和酸甜游離氨基酸總味感強度考慮，合適的發酵時間在80～110 d。

酸肉發酵中乳酸菌及有機酸組成成分分析顯示，乳酸菌在發酵中迅速增加，發酵50 d后保持穩定的波動變化。總有機酸隨發酵時間延長逐漸增加，總有機酸味感強度和含量高值出現在發酵80～110 d，主要的有機酸是酒石酸和乳酸，乳酸隨發酵時間延長逐漸增加并保持在高值，表明長時間采用發酵方式保藏酸肉可改變酸味感。

感官評價顯示酸肉發酵保藏50～80 d評分較高，滋味氣味評價顯示在發酵50～110 d最高。經與酸、鮮相關成分相關性分析顯示酸肉感官品質及滋味氣味品質與酒石酸及總有機酸味感強度極顯著正相關(p<0.01)，滋味氣味與總有機酸含量顯著正相關(p<0.05)，而與蛋白質各降解產物無顯著相關性。表明酸肉品質受多種因素的影響。

從本研究結果看，采用發酵的方式保藏酸肉，時間不宜超過110 d，最佳食用時段是發酵50～80 d。