動物源性食品檢測磺胺類殘留ELISA試劑盒的研制

謝體波，龔維瑤，鐘新敏，吳紫潔，程茹，張凱，袁光宇

(貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州 貴陽，550009)

動物源性食品中獸藥殘留對人體健康的影響已成為食品安全問題之一，獸藥的殘留最終會富集人體內而影響人類健康。磺胺類藥物作為抗生素使用受到廣泛關注，該藥物具有抗菌廣譜、藥效穩定、價格便宜等優點，被廣泛應用于飼料添加劑與動物疫病治療[1-3]。在缺乏有效監管的情況下被過分濫用，導致許多動物源性食品中大量殘留。我國農業部及歐美國家都規定了磺胺類在動物性食品中的最高殘留限量0.1mg/kg。

目前，對磺胺類藥物殘留檢測主要通過液質聯用(HPLC-MS)[4-5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、高效毛細管電泳法(HPCE)[7-8]與酶聯免疫吸附法(ELISA)[9-10]。前三者相對專業操作強、大型儀器難以實現市場普及、快速檢測難以實現等問題，而ELISA具有微量分析方法成熟、使用方便、經濟易行等優點。ELISA檢測方法中試劑盒法因其檢測敏感性高，特異性強，檢測結果重復性好，試劑穩定、易保存，操作簡便，結果易判讀等特點，能夠很好的適合大批量快速檢測[11-12]。現階段市場檢測磺胺藥物試劑盒種類較多，但檢測相對單一[13-15]。因此，開發一種檢測多種動物性食品中磺胺類藥物殘留檢測ELISA試劑盒具有很高的實用價值。

本研究的目的是通過優化檢測板制備條件及檢測方法的建立，能夠實現對市場動物源性食品中殘留的磺胺類藥物的檢測；另外，對試劑盒的穩定性驗證，并與HPLC法就市場上部分動物源性食品進行抽檢對比，已確定建立的試劑盒檢測方法的市場應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品購自各大農貿市場及超市；抗原、單克隆抗體由北京勤邦公司提供；磺胺類標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均≥99.0%；96孔酶標板，廈門云鵬科技有限公司；ST-360型酶標儀，上海科華生物股份有限公司；化學試劑均購自國藥。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備

磺胺類藥物為小分子化合物，不具有免疫原性，將乙酰氨基苯磺酸與對氨基苯甲酸合成磺胺類半抗原，再將磺胺類藥物半抗原與BSA偶聯，分析計算結合比為15∶1。

1.2.2 檢測參數的建立

(1)包被液的篩選。對比3種包被緩沖液：0.02 mol/L pH=7.2的PBS緩沖液，0.05 mol/L pH=9.6的碳酸鹽緩沖液，0.02 mol/L pH=7.2的Tris緩沖液，篩選最佳包被緩沖溶液。

(2)抗體、酶標二抗稀釋液的篩選。對比3種抗體稀釋液：常規抗緩A，含0.1%明膠抗緩B，含0.1%甘油抗緩C。

(3)抗原、抗體和酶標二抗濃度的確定。采用控制變量法和參考羅貴昆等[16]的參數確定方法結合檢測IC50值、雞肉樣品添加回收和吸光度值選定最佳濃度。

(4)競爭反應時間和顯色時間的確定。分別設定競爭反應時間為0、15和30 min；顯色時間分別設定為5、15、30和45 min。對比反應吸光度值確定最佳反應時間。

1.2.3 ELISA方法的建立

配制磺胺標準溶液，定容后逐級稀釋配制以下質量濃度：1、3、9、27和81 ng/mL溶液。按照以下步驟操作：①設置0標準點與標準點，按標準品濃度梯度加入50 μL/孔，每個梯度設兩孔，每孔加入50 μL SAs單克隆抗體，25 ℃孵育上述最佳競爭反應時間后，0.01% Tween-20 0.01 mol/L pH=7.2的PBS緩沖液洗板3～5次；②加入酶標二抗，25 ℃孵育后，洗板3～5次；③加入100 μL/孔TMB避光顯色上述最佳顯色時間后，50 μL/孔2 mol/L硫酸終止反應后，酶標儀450/630 nm測定OD值。

1.2.4 樣品添加回收實驗

在蝦仁、豬肉、雞肉、牛奶中添加不同濃度的磺胺藥物標準品，通過設計回收方法計算添加回收率和批間、批內變異系數來確定試劑盒準確度。蝦仁、豬肉、雞肉、牛奶樣品添加3組不同濃度磺胺藥物，且每組設3個平行，用3個不同批次試劑盒檢測。稱取2.0 g均質后的蝦仁、豬肉、雞肉樣本，添加磺胺類藥物標準品；加入5～10 mL乙腈-乙酸乙酯溶液混勻，3 000 r/min室溫離心5 min；移取上層有機相至10 mL玻璃試管，50～60 ℃水浴氮氣流下吹干；加入1 mL正己烷和1 mL PBS混勻，3 000 r/min室溫離心5 min，除去上層有機相，下層水相用于分析。向牛奶中添加磺胺類藥物標準品，3 000 r/min室溫離心15 min，除去脂肪用于檢測。

1.2.5 特異性

特異性是指交叉反應率，抗體與抗原發生結合的能力強弱。通過競爭ELISA方法測定磺胺類藥物IC50值，選擇不同磺胺藥物類似結構的藥物測定IC50值，計算交叉反應率來判斷試劑盒檢測的特異性。

(1)

1.2.6 穩定性

4 ℃穩定性試驗，從3批試劑盒中各抽出6組試劑盒，每組3盒試劑盒，每組均做4 ℃ 4個時間段第0、1、3、6月的保存試驗。分析標準曲線的變化，檢測數據變異系數。

1.2.7 試劑盒技術參數的確定

選取3批試劑盒分別檢測蝦仁、豬肉、雞肉、牛奶樣本，并將靈敏度、精密度和準確度與HPLC檢測的靈敏度、精密度和準確度進行對比。

2 結果與分析

2.1 包被液和抗體、酶標二抗稀釋液的測定

通過檢測數據分析，確定優化后的包被緩沖液選擇0.05 mol/L pH=9.6的碳酸鹽緩沖液；抗體、酶標二抗稀釋液選擇常規抗緩A。

2.2 抗原、抗體和酶標二抗濃度的測定

對IC50、50 μg/kg添加雞肉回收率和最大吸光度值的比較確定抗原的包被濃度。抗體和酶標二抗的濃度分別為20 000、2 000比較結果見表1。由表1結果可知包被抗原濃度與IC50值負相關，抗原稀釋2×104倍IC50與最大吸光度值均較好。表2結果表明抗體濃度在2×104倍稀釋時，最大吸光度值、樣品添加回收率和IC50均處于最佳狀態，兩者濃度比為2×104∶4 000時由于酶標二抗的濃度降低，靈敏度不高。

表1 抗原濃度的測定Table 1 The determination of antigen concentration

表2 抗體和酶標二抗濃度的測定Table 2 The determination of antibody concentration and enzyme labelled antibody concentration

2.3 競爭反應時間和顯色時間的測定

不同的孵育時間結果見表3。在25 ℃環境中，50 μL/孔樣品溶液或標準品溶液，再加入50 μL/孔單抗工作液，加入酶標二抗0、15和30 min后的時間比對，結果表明加入酶標二抗的時間為30 min時，吸光度值、IC50和曲線線性均較好。

表3 競爭反應時間的測定Table 3 The determination of competitive reaction time

不同時間加入終止液，終止底物顯色液與酶的反應，結果見表4。由表4結果可知吸光度值與時間成正相關，15 min的顯色反應，其吸光度值與IC50值均較好，且曲線相關系數R2為0.993。

表4 顯色時間的測定Table 4 The determination of coloration time

2.4 ELISA標準曲線的測定

建立競爭反應曲線，以標準品百分吸光率為縱坐標，以磺胺類標準品濃度的對數為橫標，繪制標準曲線如圖1所示。通過計算曲線參數方程為y=-0.387 7x+0.728，相關系數R2=0.991 8，說明試劑盒線性關系良好，IC50值為3.88 ng/mL，線性檢測范圍1.18～41.67 ng/mL。

圖1 標準曲線圖Fig.1 standard curve

2.5 準確度(添加回收實驗)

將磺胺類藥物添加至終濃度為10、50、100 μg/kg，每種樣品、每個濃度各5個平行，用試劑盒提供的操作方法測定。抽取3批試劑盒，每批試劑盒測定同一份樣品3次，分別計算批內、批間變異系數及回收率，結果見表5。由表5可知磺胺類藥物在四類動物源性樣品中回收率在67.4%～117%，批間變異系數<10%，批內變異系數<10%。

表5 準確度測定結果Table 5 Results of accuracy on chicken samples

2.6 特異性

競爭法測定磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、酞酰磺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺吡啶的IC50及交叉反應率，結果見表6。由表6可知該試劑盒對磺胺類似藥物的交叉反應率均較高，對幾種藥物均具有較高的特異性。

2.7 穩定性

選3批試劑用于確定試劑盒的穩定性，4 ℃條件保存。放置0、30、90與180 d后測定磺胺類藥物的回收率和批內差異，結果見表7。由表7可知該試劑盒在4 ℃條件保存各時間段在樣品中的添加回收率差異不顯著，批內、批間變異系數均<10%，各項參數穩定。說明該試劑盒能夠長期保存。

表7 穩定性的測定Table 7 Determination of the stability of kit

2.8 與高效液相色譜結果比較

2.8.1 靈敏度的比較

用本試劑盒建立方法和高效液相色譜法[17]分別測定市場隨機抽選的蝦仁、雞肉、豬肉、牛奶樣品各5分，共計20份樣品，結果見表8。自制試劑盒檢測方法中，取3個批次試劑盒，3個平行，求平均值；由于儀器方法的最低檢測限為10 μg/kg，低于10 μg/kg的樣品用“-”符號表示。由表9可知試劑盒建立方法和高效液相色譜法陰陽性結果復核率為100%，檢測20個樣品共有10個樣品為陽性樣品。

表8 靈敏度比較Table 8 Comparison of the sensitivity of ELISA and HPLC

2.8.2 準確度和精密度的比較

用同樣方法，以50 μg/kg濃度對空白蝦仁、雞肉、豬肉、牛奶樣品進行磺胺類藥物添加回收試驗，比較儀器檢測方法和自制試劑盒檢測方法的平均回收率和變異系數。自制試劑盒檢測方法中，取3個批次試劑盒，3個平行，計算變異系數。

由表9可知高效液相色譜檢測方法以50 μg/kg濃度添加，回收率在85.0%～93.7%，變異系數在1.7%～6.0%。自制試劑盒以50 μg/kg濃度添加時，回收率在75.6%～112%，批間變異系數<10%，批內變異系數<10%，適于實際樣品的檢測。

表9 準確度和精密度比較結果Table 9 Comparison of the accuracy and accuracy of ELISA and HPLC

3 討論

不同包被緩沖液的選擇及抗原、抗體和酶標二抗濃度配比對IC50、吸光度值均有較大影響。對比結果表明3種包被緩沖液中碳酸鹽緩沖液優于其他2種緩沖液，更利于抗原吸附于本研究用酶標板。另外，隨著包被抗原稀釋濃度在一定范圍增加，IC50、吸光度值均降低，最終確定最佳包被抗原稀釋2×104倍；抗體∶酶標二抗的相對比對檢測數據也有較大影響，分析實驗數據可知抗體濃度的降低，吸光度值隨之降低，酶標二抗濃度的降低，靈敏度下降。綜合考慮IC50、吸光度值及添加回收率選擇最佳比例2×104∶2000。

在反應時間上的確定，實驗數據顯示隨著最佳反應時間之后繼續延長反應時間，所得曲線相關系數呈下降趨勢，結果與真實值相差較大。根據實驗數據確定了試劑盒的檢測方法：樣品溶液或標準品溶液50 μL/孔，抗體工作液50 μL/孔，在25 ℃反應30 min，洗板，加入酶標二抗100 μL/孔，在25 ℃反應30 min，加入底物顯色液100 μL/孔，在25 ℃反應15 min，終止，酶標儀于450/630 nm測定OD值。

對于試劑盒的穩定性驗證，僅進行了4 ℃條件下保存，有一定的局限性。沒有能夠覆蓋多個差異溫度，因此在實際市場使用過程中還有待驗證，但本試劑盒的實驗結果仍屬于較好范圍內，只要進行合理的保存，仍然能夠滿足市場的檢測需求。本研究通過對動物源性食品添加回收建立的樣品分析方法與HPEC檢測方法檢測市場樣品，檢測陰陽性結果復核率為100%，準確度、精密度數據符合度均較高，表明本試劑盒能夠滿足HPLC樣品初篩和適應現場檢測。