紅曲黃色素的多樣性及產品標準的討論

張薄博，管宏偉，陳磊，黃濤，許贛榮*，吳振強

1(江南大學 生物工程學院,糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 2(華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州,510006)

食品著色劑(色素)是食品工業不可或缺的食品添加劑之一。食用色素通常分為化學合成色素和生物色素。天然的生物色素中，紅曲色素(包括紅曲米色素及紅曲紅色素)是世界上最成功的利用微生物發酵法大規模生產的、并廣泛應用于食品的天然生物色素，其歷史悠久，生產技術成熟，價格便宜。紅曲色素是包括紅曲紅色素、紅曲黃色素、紅曲橙色素在內的多種色素的混合物，作為與紅曲紅色素結構類似的同系物中的紅曲橙色素和紅曲黃色素這2種天然色素，尚未工業化生產。

從感官上來講，黃色素是最為醒目的色素類型之一，且許多食品也多呈現黃色，故黃色素是最重要的食用色素品種之一。像甜點、冰激淋、奶油、人造奶油、油脂、玉米片、起酥油、調味色拉油、面包、通心面、飲料、肉制品(火腿、香腸)、干酪、餅干、方便面等產品中，使用黃色素的場合明顯多于其他色調的色素，因此推測黃色素的產量和用量都應超過紅色素。

在紅曲行業，普遍被人們接受的觀點是，紅曲黃色素中，最常見的2種化學物質是紅曲素和安卡紅曲黃素。近幾十年來，國內外研究者對紅曲黃色素及其生產技術的研究在不斷深入。人們對紅曲黃色素的認知也在不斷加深，現在可以明確的是，由于紅曲菌種的多樣性及生產方法的不同，紅曲黃色素的種類和性能呈現多樣性。近幾年，紅曲行業內值得一提的是，一種利用紅曲色素為原料，通過化學合成方法制得的“紅曲黃”已經面世，且制定了紅曲黃色素產品的國家標準(GB1886.66—2015)。更為值得關注的是天然紅曲黃色素，現在也可以像紅曲紅色素一樣，通過發酵法大規模生產。因此，現有的紅曲黃產品國家標準中的相關定義和指標等都值得商榷。針對這些問題，本文根據對紅曲黃色素現有知識的掌握，從其種類和性質，生產檢測方法及產品標準等方面進行了較為系統的闡述和討論，為讀者進一步全面了解紅曲黃色素提供方便，為今后紅曲黃色素國家標準的修改提供參考。

1 紅曲黃色素的多樣性

1.1 紅曲黃色素的種類和結構多樣性

目前，已有94種紅曲色素被報道，其中有44種黃色素，8種橙色素以及42種紅色素[1]，在這已被發現的44種紅曲黃色素中，以疏水性黃色素為主，這就包括上述2種經典的紅曲黃色素，即分別于1969年和1973年被發現的紅曲素和安卡紅曲黃素[2-3]，它們的分子結構如圖1所示。

圖1 兩種經典的紅曲黃色素的分子結構Fig.1 The structure and molecular weight of two typical Monascus yellow pigments

此后，不斷有新的紅曲黃色素被發現。WU等在2011年使用叢毛紅曲菌BCRC 38093經紅曲米發酵獲得4種新的天然紅曲黃色素，經鑒定為疏水性的吡啶類生物堿，并分別命名為monasnicotinate A、B、C和D[4]。同年，CHENG等使用紫色紅曲菌BCRC 38038經紅曲米發酵得到一種新的紅曲黃色素purpureusone，經結構鑒定為一種環己烯酮類化合物[5]。另一方面，李健在2010年分離鑒定了4種親水性的紅曲黃色素A-1、A-2、C-1和C-2[6]，以上所述的幾種黃色素的結構如圖2所示。

圖2 部分黃色素的分子結構Fig.2 The structure of some Monascus yellow pigments

1.2 紅曲黃色素性能的多樣性

1.2.1 色調及最大吸收波長

紅曲色素是紅曲菌發酵的次級代謝產物，從結構上來說基本屬于聚酮類化合物，通常為紅、橙、黃3種色素的混合物，它們的最大吸收波長分別在490～530，460～480，330～450 nm[7]，可見，紅曲黃色素的最大吸收波長范圍較大，這也是與其結構和性質的多樣性緊密相關的，其中最常見的2種紅曲黃色素，即紅曲素和安卡紅曲黃素的最大吸收峰分別為420 nm和388 nm[8]。

不同種類的紅曲黃色素在薄層層析中所跑出的條帶Rf值不同，色調也有差異。江南大學許贛榮等使用薄層層析對脂溶性紅曲黃色素進行了分離，結果如圖3所示。可見光下發現2條黃色素條帶，紫外光下可見上方條帶比下方條帶亮。Rf值分別為0.869、0.817，最大吸收峰分別出現在421、409 nm處[9]，分離的黃色素的純度未經嚴格檢測。

圖3 紅曲黃色素在薄層層析上的分布[9]Fig.3 The distribution of Monascus yellow pigments on thin layer chromatography

有結果顯示親水性的紅曲黃色素的最大吸收波長比疏水性的紅曲黃色素小。例如，HUANG等通過紅曲菌發酵直接獲得的水溶性黃色素的最大吸收峰為350 nm，遠低于同時獲得的疏水性黃色素的最大吸收峰410 nm[10]。

1.2.2 溶解性

根據現有的研究報導，紅曲菌發酵所產的黃色素主要有疏水性和親水性兩大類，目前占大多數的是疏水性的紅曲黃色素。疏水性的紅曲黃色素一般具有13、17、19、20、21、22或23個碳原子，而親水性的紅曲黃色素則一般具有21或23個碳原子，且其平均分子量在344到404之間，因此，在結構的多樣性上，疏水性的紅曲黃色素要高于親水性的黃色素[11]。疏水性的紅曲黃色素由于具有較多的不飽和C-C雙鍵，因此，其極性要低于親水性的紅曲黃色素。疏水性的紅曲黃色素在有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮、己烷、乙苯、乙酸乙酯、油脂)中溶解性較好，而親水性的紅曲黃色素則可以直接從紅曲菌的發酵液中獲得。

1.2.3 穩定性

和其他大多數的天然色素相似，紅曲黃色素在穩定性方面也同樣面臨著較大的挑戰，它會受pH、金屬離子、溫度和光照等因素的影響，而引起一定程度上的變色、褪色，這會影響并制約著紅曲黃色素在食品行業的推廣和應用。因此，如何提高紅曲黃色素的穩定性是研究者和相關行業人士都非常關注的問題，但由于紅曲黃色素仍未工業化生產，目前與紅曲黃色素穩定性相關的研究仍相對較少。相對而言，親水性的紅曲黃色素比疏水性的紅曲黃色素具有更高的穩定性。親水性的紅曲黃色素在不同的pH條件下(pH為4、6和9)對多種金屬離子(如Mg2+、Sn2+、Ca2+、Fe3+和Al3+等)有良好的耐受性，并且在一個較廣的pH范圍內(pH 2～10)具有相對較好的穩定性[12]。但極酸極堿性環境仍會在一定程度上不利于紅曲黃色素的保存，應盡量保存在中性環境下。此外，紅曲黃色素的熱穩定性良好，在100℃下加熱60 min后紅曲黃色素的保存率仍然在95%以上，這對于食品熱加工來說具有很好的應用價值。在光學穩定性方面，相比于紅曲紅色素，紅曲黃色素在紫外光和可見光的條件下穩定性更高[13]。但紅曲黃色素的穩定性會隨著自然光照時間的延長而逐漸降低，而通過避光處理，紅曲黃色素會顯現出較好的穩定性[14]。由此可見，環境中pH、金屬離子、溫度和光照等因素對紅曲黃色素的穩定性都有一定的影響，如何在生產、應用和儲存過程中避開各種易造成其不穩定的因素，將更利于紅曲黃色素的進一步開發和應用。此外，通過添加色素穩定劑，例如抗氧化劑，也可有效地提高紅曲黃色素的穩定性[15]。

1.3 紅曲黃色素生產方法及其產品應用的多樣性

1.3.1 生產方法的多樣性

紅曲菌的代謝產物，以色素產物最為眾多。紅曲菌屬下種的分類，有不同的觀點。國外有專家認為紅曲素可分為3個種，而我國著名的紅曲專家李鐘慶先生認為紅曲屬可分為12個種。不同的菌種，其所產生的色素種類和相對含量也是不同的。

紅曲黃色素產品的生產方法，包括提取法、半合成法和發酵法。發酵法包括傳統的固態發酵法和現代的液態發酵法。液態發酵法又根據不同的方法可分為常規的液態發酵法和萃取發酵法。不同的發酵工藝條件均可改變發酵色素的種類及其含量的比例。

圖4-a是泰國科學家利用紅曲菌固態發酵法生產的“黃金米”。江南大學與合作企業的液態發酵紅曲黃如圖4-b所示。由圖4-c可看出，固態發酵紅曲米中所含有的黃色素與液態發酵所得到的紅曲色素中的黃色素相比，其種類要多。

20世紀20年代就有日本人提取法生產紅曲黃色素的報道，紅曲米一般都含有紅、黃、橙色素，故用溶劑可從紅曲米中提取黃色素，但此法收率不高。泰國科學家在20世紀90年代開始了紅曲黃色素產生菌的篩選及發酵試驗，先后進行了液態發酵及固態發酵法生產紅曲黃色素，但泰國的紅曲黃色素一直停留在研究層面，未實現工業化生產[16-17]。我國華南理工大學、江南大學、華中農業大學等高校先后都從事了液態發酵生產紅曲黃色素的研究工作[18-19]。

a-黃金米與正常的紅曲米；b-液態發酵紅曲黃色素； c-紅曲紅和紅曲米的板層析 (上：液態發酵紅曲紅乙醇溶解物；下：固態發酵紅曲米乙醇提取物)圖4 固態發酵紅曲“黃金米”，液態發酵 紅曲黃色素，紅曲紅和紅曲米的板層析Fig.4 “Golden rice” produced by Monascus solid- state fermentation, the yellow pigments produced by liquid fermentation, the TLC of Monascus pigments

在紅曲菌發酵過程中，合成的黃色素的種類和產量會受到菌種、發酵方式、發酵條件以及培養基的成分的影響。為了提高紅曲黃色素的積累，可通過優化紅曲菌發酵條件得以實現。例如，低pH值有利于黃色素和橙色素的積累，而相對較高的pH和氨基氮源的存在有利于形成紅色素。CHEN等利用補料分批發酵，在提高紅曲菌體濃度的同時，使細胞內色素的最大吸收峰逐漸轉變為410 nm，大大提高了發酵結束時紅曲黃色素的色調值[20]。

近些年來，微生物萃取發酵已成為一種新興的發酵方法，可以通過該方法積累更多的紅曲黃色素。另外，通過添加一些非離子型表面活性劑，也可以促使紅曲菌胞內橙色素向黃色素的轉化[21-22]。在通過研究闡明了發酵條件、紅曲菌形態以及黃色素產量的基礎上，江南大學研究團隊通過自主創新，采用新型的發酵技術和提純技術，攻克了高產紅曲黃色素生產關鍵技術，相關成果已獲得專利授權[23]，紅曲黃色素發酵水平獲得顯著提高，目前采用液態發酵紅曲黃色素搖瓶發酵水平均達到500 U/mL以上，機械攪拌發酵罐發酵水平達400 U/mL左右，該項目目前正處于中試階段[24-25]。

除此之外，通過半合成法也可以將一些疏水性的紅曲色素轉化成親水性的紅曲黃色素。例如，一些疏水性的紅曲色素與硼氫化鈉反應可以得到親水性的紅曲黃色素。使用一些磺化劑如硫磺、三氧化硫和氯磺酸，也可以使疏水性的紅曲紅色素轉化為親水性的紅曲黃色素。雖然可以通過這種半合成的方法得到更多的紅曲黃素色，但其潛在的安全性問題可能會限制它們在食品工業中的應用。

1.3.2 應用多樣性

由于化學合成色素存在著較大的食品安全問題，當今在國際市場上，越來越青睞天然色素。屬于食用色素新產品的天然紅曲黃色素的工業化生產及應用，順應了歷史發展潮流，因而具有廣泛的市場前景。

在應用方面，紅曲黃色素作為無毒無害的天然色素，可廣泛用于食品行業，像甜點、冰激淋、奶油、人造奶油、油脂、玉米片、起酥油、調味色拉油、面包、通心面、飲料、肉制品(火腿、香腸)、干酪、餅干、方便面等產品中。隨著研究的不斷深入，研究者發現紅曲黃色素除了在食品工業中的應用外，還具有眾多的生理活性，如抗癌、抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗肥胖、抗炎等。此外，有文獻報道，由于紅曲黃色素具有提升高密度脂蛋白的功效，使其作為一種潛在的降脂藥，在醫藥行業將有廣泛的應用[26]。不僅如此，紅曲素和安卡紅曲黃素還有助于提高記憶力以及學習能力，有可能用于抑制阿爾茨海默病[27]。由此可見，當在合適的劑量內，紅曲黃色素可作為有效的功能物質用于保健食品或醫藥中。隨著紅曲黃色素這些生理活性功能的不斷發掘，其應用范圍將更加廣泛。

2 對紅曲黃色素國家標準變更的建議

中國于2015年年底頒布了紅曲黃色素國家標準(GB 1886.66—2015)。但此標準中所說的紅曲黃色素，并非天然紅曲黃色素，而是由紅曲紅色素與含硫的磺化物在堿性溶液中反應后所制得的半合成色素(紅曲紅色素分子中的內酯被水解，同時在分子結構中引入了磺酸基團)。鑒于天然紅曲黃色素發酵生產技術的日趨成熟，從事天然紅曲黃色素生產與應用的行業人士都普遍認為，通過發酵法直接得到的天然紅曲黃色素也應在紅曲黃色素產品的國家標準中占有一席之地。現有國家標準中對于紅曲黃色素的相關定義和指標等都值得展開進一步的討論。

2.1 對國家標準中紅曲黃色素的定義和生產方法相關內容的討論

目前作為食品添加劑的該國家標準中(GB 1886.66—2015)中對紅曲黃色素的定義范圍是：以紅曲米為原料，經堿液洗脫，分離制得紅曲紅(或直接以紅曲紅為原料)，經硫化物磺化、干燥制成的食品添加劑紅曲黃色素。目前市場上已經出現半合成的“紅曲黃”色素，而且這一色素產品已經有了國家標準。

從該國家標準的定義來看，該“紅曲黃”色素實際上屬于半合成類的紅曲黃色素，無法歸于“天然”色素類。它是由紅曲紅色素與磺化物在堿性溶液中反應后(紅曲紅色素分子中的內酯被水解，同時在分子結構中引入了磺酸基團)所制得的，因此，嚴格意義上來說，它是一種半化學合成色素，并非由紅曲菌直接發酵得來，不是純天然的紅曲黃色素,而且它是多種色素形成的混合物；故其檢測波長并不在傳統黃色素的檢測波長范圍內。

天然的紅曲黃色素是直接由菌體生物合成代謝產生的，即通過紅曲菌直接發酵、提取、濃縮、精制而得到的產品，未經體外化學修飾，是公認的天然色素。而且在20世紀20年代，就有通過提取法制備的天然紅曲黃色素問世，更值得關注的是，在最近十多年來，天然紅曲黃色素的生產也達到了較高的水平，產品近于定型，故“紅曲黃”色素的國家標準中不應當排斥這種天然的紅曲黃色素。在今后該產品的國家標準修改時，可以通過修改紅曲黃色素的定義，將發酵法直接獲得的天然紅曲黃色素納入國家標準中。

2.2 對國家標準中紅曲黃色素檢測方法相關內容的討論

在現有的紅曲黃色素國家標準中(GB 1886.66—2015)，對紅曲黃色素的描述是易溶于水，外觀為橙紅色或黃褐色的粉末，檢測時經水稀釋后使用分光光度計測定其在(476±10) nm處的吸光度值，進而計算出色價。但是476 nm這個波長，實際上是針對橙色素的。黃色素的最大吸收峰的波長一般都小于450 nm。

由于紅曲黃色素種類的多樣性，如果以高效液相色譜為基礎來對紅曲樣品中的色素種類和含量進行檢測分析，則需要所有的色素成分的標品，并建立方法進行分析，這樣做的工作量太大，而且有些色素的含量很少，實用價值較低。因此，可以通過板層析等方法，找到樣品中幾種主要的有代表性的紅曲黃色素，針對這幾種主要的黃色素進行高效液相色譜的檢測。除此之外，液相色譜-質譜聯用技術在紅曲色素產品的分析方面有著其獨特的優勢，將該技術應用于紅曲色素的檢測應該是今后國家標準發展的方向之一。

現有的紅曲黃色素國家標準(GB 1886.66—2015)以及目前行業內習慣使用的仍是以分光光度計為基準的檢測方法，該方法仍然適用于天然紅曲黃色素的檢測，在實際應用中也更為方便可行，但其關鍵是稀釋溶劑種類及檢測波長的確定。對于稀釋溶劑的種類，由于存在疏水性和親水性的紅曲黃色素，并考慮到兩種類型的黃色素在乙醇中的溶解度都較高，根據我們的實踐，證明用一定濃度的乙醇水溶液作為溶劑仍是較好的選擇。對于檢測波長，根據文獻報道的天然紅曲黃色素種類較多的具體情況，檢測波長應當設置在較大的范圍內，天然紅曲黃色素的乙醇溶液，在330～450 nm有最大吸收峰。因此檢測波長可定于此范圍內，這也有別于半合成的“紅曲黃”的檢測波長(476 nm)。

2.3 對現有紅曲黃色素國家標準變更的建議

根據以上所述的情況，我們建議在現有的紅曲黃國家標準中，宜增加天然紅曲黃色素產品(疏水性和親水性兩大類)。建議該天然紅曲黃色素的定義可修訂為：采用紅曲菌(Monascusspp.)，利用固態基質或液態培養基，經發酵、提取、濃縮、精制而得到的天然黃色素。主要用于食品工業中作為著色劑。

現有的紅曲黃色素國家標準中，紅曲黃色素的檢測主要是使用分光光度計檢測其在476 nm處的吸光度值。因此，有必要在現有的紅曲黃國家標準中添加天然紅曲黃色素的檢測方法，即仍采用分光光度法，但對稀釋溶劑和檢測波長做一定的修改，修訂為：將紅曲黃色素溶于乙醇溶液，檢測時經乙醇溶液稀釋后，使用分光光度計測定其在330～450 nm的最大吸收峰，通過最大吸收峰處的吸光度值，計算出色價。

綜上所述，我們已經根據對紅曲黃色素現有知識的掌握，對已有的國家標準進行了討論，為讀者進一步全面了解紅曲黃色素提供方便，為今后紅曲黃色素國家標準的修改提供參考。