剪切力敏感型微生物形態塑造及其在檸檬酸發酵中的應用

王寶石，李林波，譚鳳玲，付小敏，張明霞*

1(河南科技學院 生命科技學院，河南 新鄉,453003) 2(現代生物育種河南省協同創新中心，河南 新鄉,453003)

檸檬酸(citricacid)為無色、無臭顆粒粉末，具有強烈酸味，為動植物體內的天然成分和生理代謝的中間產物，是一種非常重要的平臺化合物[1]，也是當前世界上產量和消費量最大的食用有機酸[2]。檸檬酸主要合成方式為微生物發酵法，約有99%的產品是采用此方法生產[3]。因為絲狀真菌黑曲霉有酶系豐富、發酵效率高、副產物少等優勢，所以在工業化生產中，超過80%檸檬酸產品是由黑曲霉液體深層發酵獲得[4]。但在液體培養體系中，其獨特的形態學特征會顯著影響產品的產量。因此，以黑曲霉為代表的絲狀菌形態學解析、塑造及其調控一直是現代工業發酵研究的熱點[5]。

1 菌絲球形成機理

在液體培養體系中，與細菌、酵母發酵過程相比，絲狀真菌黑曲霉呈現復雜的形態學特征，如高度游離的菌絲，菌絲纏繞疏松的菌絲團以及菌絲纏繞緊密的菌絲球[5]；在攪拌條件下的液體培養體系，更易產生非均相體系，影響耗氧發酵的兩個關鍵過程——溶氧(dissolvedoxygen)和傳質過程(masstransfer)，進而影響菌體生長和發酵產率[6]。在檸檬酸工業化生產中，發酵菌種黑曲霉孢子擴大培養需要經平板篩選、斜面培養、茄子瓶培養、麩曲桶培養等逐級擴大培養獲得成熟的孢子，如圖1所示，制備過程繁瑣且周期長(制備周期超過30d)；然后在液體培養體系中獲得成熟的種子。

圖1 工業化規模產檸檬酸黑曲霉的擴大培養 Fig.1 Expanding cultivation of A. niger producing citric acid cultured in industrial scale

由于在連續培養過程中黑曲霉特殊的菌絲體結構，會造成溶解氧運輸受到限制，進一步導致細胞代謝與檸檬酸合成異常，檸檬酸生產仍然以分批發酵模式存在，其能效較低，已成為檸檬酸產業提升的瓶頸。

絲狀真菌首先由休眠孢子吸水膨脹，逐漸萌發形成菌絲，菌絲進一步生長，形成大量的游離菌絲，游離菌絲相互纏繞形成菌絲球，圖2為產檸檬酸黑曲霉液體培養時的形態學特征。根據孢子在萌發初期的聚集特性，菌絲球形成機制可分為非凝集性(non-coagulatingtype)和凝集性(coagulatingtype)兩種類型[7]。非凝集型孢子的菌絲球形成會受到孢子濃度影響，低接種量會加速菌絲球形成。孢子聚集過程受到培養基組成、孢子活力、接種量以及機械攪拌因素的影響，主要發生在兩個階段:(1)接種后發生聚集，此過程僅受到滲透壓和pH值影響；(2)萌發后發生聚集，不僅受到滲透壓和pH值影響,還受到通氣和攪拌的影響。在絲狀真菌的液體培養體系中，只有準確把握孢子聚集類型以及其接種量，才能準確評估菌體的形態學特征。

圖2 產檸檬酸黑曲霉液態培養時的形態學特征 Fig.2 Morphological characteristics of A. niger producing citric acid when cultured in liquid culture

2 形態學分析

絲狀真菌形態學特征可分為微觀形態學特征和宏觀形態學特征。微觀形態學特征直接受到發酵環境的影響，它是宏觀形態學特征的外觀呈現。在液體培養體系中，菌絲團或菌絲球的培養形式，可以降低發酵液黏度，提高傳質與溶氧過程，同時利于菌體與產品的分離；但菌絲球核心與營養物質的運輸存在限制擴散，形成生產率下降的“盲區”[5]。在工業化生產中，游離菌絲狀的培養方式改善細胞生長速率與產率比較常見，但對于檸檬酸發酵生產來說，菌絲團或菌絲球更適合[8]。菌絲球的宏觀生長表現為菌絲球半徑的增加，但隨著菌絲球半徑的增加，發酵體系營養物質至菌絲球內部運輸受到限制，因此菌絲球存在臨界半徑[9]。精確界定菌絲球的臨界半徑，對于準確控制發酵過程具有重要的意義。為了正確表征菌絲球的宏觀形態學特征，EMERSON[10]首先提出了菌絲球的生長模型-立方根定律，菌絲球殼芯的寬度恒定，殼芯生物量因底物限制而不參與生產過程，其生長僅發生在菌絲球殼外圍，以恒定的比生長速率生長，直至菌絲球臨界半徑。此模型的提出為定量分析絲狀真菌形態學特征奠定了基礎。

絲狀真菌形態學在發酵過程中扮演重要角色，無論菌體微觀形態(纖維狀結構)還是宏觀形態(菌絲球形態)，均會影響檸檬酸發酵過程。正因為絲狀真菌菌絲體形態學的重要性，定量分析絲狀真菌形態的技術與手段，能夠為研究者提供精細的形態學特征資料，為深入理解形態學特征與產物合成速率提供了依據[8]。近年來，定量分析菌絲的微觀形態學取得了重要進展。如表1所示，熒光壽命成像技術(fluorescencelifetimeimaging,FLIM)定量分析了黃曲霉的熒光性能[11]；原子力顯微技術(atomicforcemicroscopy,AFM)，定量分析了黑曲霉(Aspergillusniger)[12-13]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[14]及酵母細胞(Saccharomycescerevisiae)[15]的黏附力和力學性能；接觸角測量技術(contactanglemeasurement,CAM)，定量分析了構巢曲菌(Aspergillusnidulans)[16]與近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)[17]的表面疏水性與黏附性；Zeta電位分析技術(zetapotential,ZP)，定量分析了黑曲霉(A.niger)孢子及其聚集體的靜電特性[18-19]。微觀形態學特征的發展，為深入理解絲狀菌的宏觀形態學特征提供了參考。

表1 菌體微觀形態學特征分析的研究進展Table 1 Research progress of microbial morphological characteristics

近年來，定量分析菌絲宏觀形態學也取得了重要進展，一些新興分析技術手段用于解析宏觀形態學特征，如表2所示。聚焦式激光反射技術(focused beam reflectance measurement, FBRM)，定量分析了黑曲霉顆粒弦長及其分布[20-22]；共聚焦激光掃描顯微技術(confocal laser scanning microscopy, CLSM)，定量分析黑曲霉的菌絲球表面特征、菌絲梯度分布及其蛋白表達區域定位[23-24]；激光衍射技術(laser diffraction technique, LDT)，定量分析了黑曲霉的折射率和散射強度[21, 25]；數字圖像分析技術(digital image analysis system, DIAS)，定量分析了菌絲頂尖生長、菌絲球形態及其數量，菌絲球最大直徑及其密度[26]。顆粒切片與沉降技術(pellet slicing and sedimentation, PSS)，定量分析了黑曲霉的菌絲球顆粒表面與內部結構及其沉降阻力[27]。微電極技術(microelectrode technique, MT)，定量分析了Penicilliumchrysogenum[28]，A.niger[29]，Aspergillusawamori[30]的溶氧濃度、滲透系數及其溶氧擴散深度。流式細胞技術(flow cytometry, FC)，定量分析了A.niger[31]，Bacillusanthracis[32-33]的菌絲球顆粒大小及密度分布，全細胞熒光活力。定量分析技術在絲狀菌宏觀形態學與微觀形態學的發展，為深入理解發酵過程形態學特征變化規律，在工程水平上精確調控菌絲體形態，提高發酵效率奠定基礎。

表2 菌體宏觀形態學特征分析的研究進展Table 2 Research advances in macroscopic morphological characteristics of strain

3 形態學工程

形態學分析手段的發展，為研究者在工程水平上控制菌絲特征提供了非常好的思路。環境條件會顯著影響絲狀菌的形態學特征[5]，表3展示了過程水平上控制菌體形態學特征的研究報道。通過調整孢子接種量及轉換pH的方法[8, 22, 37-39]，基于菌體生長與群體效應，可以有效調控A.niger,Aspergillusoryzae,Aspergillusterreus,Rhizopusoryzae的形態學特征。通過調整通氣與攪拌條件，改變發酵體系機械能量輸入[40-43]。增加能量輸入，體積溶氧系數(kLa)與生物量，成功用于調控A.niger,R.oryzae,A.oryzae,Trichodermareesei,P.chrysogenum的菌絲球結構，菌絲球濃度增加，進而提升了發酵效率。基于調節滲透壓[44-47]，改變菌體的生理學特征，從而調整了A.niger的形態學特征。微粒包埋法[48-52]，包埋固定化菌絲體，可以有效控制顆粒直徑與濃度。形態學工程的蓬勃發展，為工業化控制絲狀菌的發酵過程提供了借鑒。

表3 基于過程水平控制絲狀菌形態學的研究進展Table 3 Research progress in controning fungal morphology on the process level

在黑曲霉發酵檸檬酸生產中，研究專家詳細分析了菌絲體的形態學特征，PAPAGIANNI[54-55]基于人工神經網絡模型將菌絲體分為游離菌絲、菌絲塊、菌絲球，并基于數字圖像分析技術(DIAS)分析了不同孢子接種量條件下的菌絲體形態特征，發現調整孢子濃度可以有效調節菌絲聚集狀態。在液體發酵體系中，攪拌對于改善溶氧與物質傳遞是非常重要的，但劇烈攪拌會產生剪切力，會引起菌絲體形態學變化[56]。PAPAGIANNI[57-58]發現攪拌在不同發酵階段產生不同影響，在發酵初期劇烈攪拌會使菌絲高度分支化，產生菌絲碎片，而在發酵后期攪拌會使細胞老化，菌體衰亡。關于適合檸檬酸發酵的黑曲霉菌體形態學特征，不同研究專家存在不同的結果。PAUL[59]，LEE[60]研究發現菌絲體形態以游離菌絲存在時，菌體比生長速率與比產酸速率明顯高于菌絲球形態。KISSER[61]，GMEZ[62]研究發現，菌絲體形態為菌絲球時產酸量更高。盡管適合檸檬酸發酵生產的菌絲體形態特征存在爭議，但產酸較高的黑曲霉菌絲一般具有尖端多且膨大的特征，精確調控菌絲體形態有助于改善檸檬酸產量。

絲狀菌在復雜的液體培養體系中，更易受到機械攪拌與通氣等因素的影響，菌絲體形態呈現多樣性，呈現從高度游離的分散菌絲到菌絲纏繞緊密的菌絲球的形態。劇烈攪拌引起的剪切力會改變菌體形態學特征并產生菌絲碎片。BELMAR-BEINY[63]利用Streptomycesclavuligerus發酵克拉維酸時，發現高攪拌產生的菌絲碎片重新生長并合成產物；PAPAGIANNI[58]，PAUL[59]發現黑曲霉發酵生產檸檬酸時，機械剪切力能夠將菌絲球表面的菌絲打散，形成的菌絲碎片會重新發育成菌絲球，如圖3所示。XIN等[42]提出了采用研缽將菌絲球磨碎成菌絲碎片，菌絲碎片在一定培養條件下會重新纏繞成菌絲球，并成功應用于污水處理。上述絲狀真菌整個生命周期形態學特征的研究進展，為精確調控與有效利用絲狀真菌黑曲霉菌絲結構提供了啟發；通過引入菌絲球分割技術，形成菌絲球—分散菌絲—菌絲球的循環模式，構建絲狀真菌分割循環的新型發酵方式，可有效規避傳統分批發酵模式能效低的缺陷。

圖3 高速攪拌條件下的菌絲形態學特征Fig.3 Morphological characteristics of mycelium under high speed stirring

4 結束語

高產量、高轉化率、高生產強度統一為目標的發酵工程技術，一直是現代工業發酵關注的焦點問題。本文以黑曲霉發酵生產檸檬酸為代表，多維度解析了絲狀菌在液態發酵體系中形態學特征及調控方法，并提出了基于現代儀器手段理解絲狀菌的微觀與宏觀形態學特征，通過引入菌絲球分割技術，建立基于形態學工程的控制手段，精確調控與有效利用黑曲霉菌絲結構，進而建立適合檸檬酸發酵模式的形態學特征，為液態培養體系中絲狀真菌形態塑造及其新型發酵模式構建提供一定參考。