非小細胞肺癌組織中NF-κB、AP-1、TLR2的表達及意義

王熠，童國強，計玉兵，付云杰

九江市第一人民醫院呼吸內科，江西 九江 332000

在揭示非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發生機制過程中，發現細胞因子的異常表達，可以影響腫瘤細胞的生物學特征，導致肺泡上皮細胞增殖、轉錄及凋亡調控過程異常，進而參與NSCLC的病情進展過程[1-2]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、轉錄因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的表達水平升高，可以通過誘導腫瘤轉錄基因的激活，增加腫瘤細胞內核基因的激活程度，進而促進腫瘤細胞的持續性增殖[3]。Toll樣受體 2（toll like receptor 2，TLR2）是識別脂多糖的特異性多肽類片段，通過影響炎性反應的激活，影響局部T淋巴細胞的免疫活性，進而干預腫瘤細胞的微環境，導致腫瘤細胞的增殖調控異常[4]。部分研究者探討了NF-κB的表達與生殖系統惡性腫瘤的關系，發現NF-κB的表達水平在卵巢惡性腫瘤患者中明顯升高[5]，但對TLR2的研究不多。為揭示NF-κB、AP-1、TLR2的表達與NSCLC的關系，本研究探討了NF-κB、AP-1、TLR2的表達與NSCLC患者臨床特征的關系，為臨床NSCLC患者的病情評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年4月于九江市第一人民醫院保存的80例NSCLC組織及其癌旁組織（距病灶邊緣＞5 cm，且經病理證實為正常肺組織）。80例NSCLC患者中，男47例，女33例；年齡為42～71歲，中位年齡為60.5歲。納入標準：①經病理學檢查確診為NSCLC；②術前未行放化療等治療；③臨床資料保存完整。排除標準：①有其他原發性惡性腫瘤；②有免疫系統疾病；③病理組織切片制作差。

1.2 實驗方法

石蠟包埋，連續性切片，厚度為3 mm，60℃烤片60 min。常規脫水后，采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）進行抗原修復，加入10 ml蒸餾水，加入10%過氧化氫5 ml，室溫下孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌3次，每次3 min；加入NF-κB、AP-1、TLR2的單克隆抗體（1∶1000，購自羅氏公司），37℃孵育60 min，PBS洗滌3次，每次3 min；加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的 NF-κB、AP-1、TLR2蛋白二抗（1∶2000，購自羅氏公司），37℃孵育20 min，PBS洗滌3次，每次3 min；加入二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）后，PBS沖洗和復染，脫水后在顯微鏡下進行觀察。

1.3 結果判斷

NF-κB主要表達于細胞質或細胞核，AP-1主要表達于細胞核，TLR2主要表達于細胞質和（或）細胞膜，呈黃色顆粒沉淀。采用半定量積分法，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞，對染色強度和陽性細胞比例進行評分。陽性細胞比例：0%為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色強度和陽性細胞比例得分相加后分數≥3分為陽性表達，＜3分為陰性表達。

1.4 觀察指標

觀察并比較NSCLC組織與癌旁組織中NF-κB、AP-1、TLR2的表達情況以及不同臨床特征的NSCLC患者的NF-κB、AP-1、TLR2表達情況，分析NF-κB、AP-1、TLR2表達的相關性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件分析數據。計數資料以例數和率（%）表示，采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織與癌旁組織中NF-κB、AP-1、TLR2表達情況的比較

NSCLC組織中NF-κB、AP-1、TLR2的陽性表達率均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 NSCLC組織和癌旁組織中NF-κB、AP-1、TLR2表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征的NSCLC患者NF-κB、AP-1、TLR2表達情況的比較

病理類型為腺癌的NSCLC患者的NF-κB陽性表達率明顯高于病理類型為鱗癌的患者，差異有統計學意義（χ2=13.038，P＜0.01）；有淋巴結轉移的NSCLC患者的AP-1陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移的NSCLC患者，差異有統計學意義（χ2=14.165，P＜0.01）；中低分化的NSCLC患者的TLR2陽性表達率明顯高于高分化的NSCLC患者，差異有統計學意義（χ2=13.382，P＜0.01）。不同性別、年齡、TNM分期、分化程度及有無淋巴結轉移的NSCLC患者的NF-κB陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同性別、年齡、病理類型、TNM分期及分化程度的NSCLC患者的AP-1陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同性別、年齡、病理類型、TNM分期及有無淋巴結轉移的NSCLC患者的TLR2陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 相關性分析

NF-κB表達與AP-1、TLR2表達呈正相關（r=0.448、0.617，P＜0.05）；AP-1表達與TLR2表達呈正相關（r=0.504，P＜0.05）。

表2 不同臨床特征的NSCLC患者的NF-κB、AP-1、TLR2的陽性表達情況

3 討論

NSCLC的發生會增加肺癌患者短期病死風險，導致肺癌患者的總體生存時間縮短[6-8]。NSCLC患者治療后的臨床轉歸預后較差，但其病死率和多器官功能衰竭的發生風險無明顯上升。越來越多的研究顯示，基礎生物學因子的改變，可以在促進NSCLC的臨床病情進展的過程中發揮重要的作用。對NSCLC患者的病灶組織中NF-κB、AP-1、TLR2的表達分析研究，具有如下兩方面的現實意義：①可以為臨床上肺癌的血清學腫瘤標志物篩查提供新的參考指標；②可以為肺癌的綜合性病情進展的評估提供依據。

NF-κB是核轉錄調控相關因子，可以提高腫瘤細胞的擴增速度，促進腫瘤基因的激活，進而增加腫瘤組織的增殖和浸潤。此外，NF-κB的表達還可以影響腫瘤細胞內MAPK信號通路的激活程度，增加下游腫瘤細胞效應因子的轉錄水平，影響惡性腫瘤的發生[9]；AP-1是轉錄調控蛋白家族成員，可以影響腫瘤細胞轉錄調控蛋白的結合程度及腫瘤細胞周期，提高腫瘤細胞S/G0期的比值；TLR2是識別脂多糖的免疫調控因子，可干擾局部腫瘤微環境，導致腫瘤細胞生物學特征顯著改變，加劇腫瘤的發生發展[10]。關于NF-κB、AP-1的表達與肺癌發生發展的研究顯示，NF-κB、AP-1的表達水平與肺癌移植瘤的凋亡密切相關[11]，但缺乏對TLR2的表達與肺癌患者臨床特征關系的分析。

本研究通過免疫組化方式探討了NF-κB、AP-1、TLR2的表達情況，發現在NSCLC組織中NF-κB、AP-1、TLR2的陽性表達率均明顯高于癌旁組織（P＜0.01），提示 NF-κB、AP-1、TLR2的表達均會影響NSCLC的發生過程。這主要與NF-κB、AP-1、TLR2的下列兩個方面的作用途徑有關：①NF-κB、AP-1表達水平升高，不僅可以提高腫瘤細胞轉錄上游啟動子的激活程度，還可以影響腫瘤細胞跨越G0期的速度；②TLR2對T淋巴細胞抗原提呈細胞的抑制作用，可以影響到T淋巴細胞的免疫逃逸過程，導致腫瘤的擴散和浸潤[12-14]。研究顯示，NF-κB在正常肺組織中的陽性表達率為15.0%，而在NSCLC組織中的陽性表達率上升至75.8%[15]，說明在具有明顯的腫瘤高負荷或者多器官功能障礙的肺癌患者中，NF-κB的上升程度更顯著。在探討相關細胞因子的表達與NSCLC患者臨床特征的關系過程中發現，肺腺癌患者的NF-κB陽性表達率較高，提示NF-κB的表達波動可能影響腫瘤細胞的發生來源，這可能由于肺腺癌患者的腫瘤細胞持續自我分泌功能的亢進，提高了NF-κB的釋放速度；有淋巴結轉移患者的AP-1陽性表達率明顯上升，這主要是由于AP-1的表達水平升高可以提高腫瘤細胞對淋巴結組織內皮細胞的黏附能力；腫瘤細胞分化程度較差或者中低分化患者的TLR2陽性表達率明顯升高，提示TLR2的表達與肺癌患者的臨床特征密切相關，TLR2表達水平升高可以導致肺癌上皮細胞的分化成熟障礙[12-15]。NF-κB、AP-1、TLR2的表達具有一定的內在關系。

NSCLC患者的NF-κB、AP-1、TLR2的陽性表達率明顯升高，同時NF-κB、AP-1、TLR2的表達與肺癌患者的臨床特征密切相關，但NF-κB、AP-1、TLR2在診斷NSCLC臨床預后過程中的作用仍然需要進一步的探討。