肝癌分化程度與肝臟CT強(qiáng)化特點(diǎn)及CD34、p53、GPC3、CK19、Ki-67表達(dá)的關(guān)系

楊曉珍，龍江，趙鵬，高文峰，張永宏

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院腫瘤微創(chuàng)介入治療中心，北京 100069

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率居中國惡性腫瘤的第4位，病死率居第3位[1]，嚴(yán)重威脅人們的健康。盡管先進(jìn)影像設(shè)備的應(yīng)用明顯提高了肝癌患者的檢出率，但是計(jì)算機(jī)體層攝影（computerized tomography，CT）仍然是大部分醫(yī)院所采用的主要放射影像診斷設(shè)備；同時(shí)，對于部分早期肝癌患者，病理診斷是必要的診斷依據(jù)。在肝癌的病理診斷中，如果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的竇內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34染色陽性，即提示肝竇已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤性毛細(xì)血管網(wǎng)。CD34的陽性表達(dá)程度與毛細(xì)血管的密集程度有關(guān)，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。p53蛋白過度表達(dá)是肝癌低分化、高轉(zhuǎn)移潛能的生物學(xué)標(biāo)志物。人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican 3，GPC3）基因編碼的蛋白屬于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，通過糖基磷脂酰肌醇錨蛋白錨定在細(xì)胞表面，可以結(jié)合肝素結(jié)合型蛋白如生長因子，調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化、黏附和遷移等行為，還可能涉及抑制或調(diào)節(jié)大部分的中胚層組織。細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）是一種低分子角蛋白，是細(xì)胞骨架蛋白的一種亞型，屬于膽管細(xì)胞型細(xì)胞角質(zhì)素。肝細(xì)胞不表達(dá)CK19；而在肝癌細(xì)胞和間質(zhì)中假膽管可陽性著色。Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)抗原，在肝癌組織中呈陽性表達(dá)。不同指標(biāo)的表達(dá)與肝癌分化程度的相關(guān)性分析，有助于進(jìn)一步了解肝癌患者預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2010年1月18日至2010年12月17日于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院診治的肝癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)肝占位活檢證實(shí)為肝癌；②接受肝動(dòng)脈導(dǎo)管介入治療或消融治療；③接受CT平掃+增強(qiáng)掃描；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：無病理結(jié)果或有肝癌以外的肝占位疾病。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入40例肝癌患者，其中男34例，女6例；年齡為38～78歲，平均年齡為（54.40±9.89）歲；乙肝35例，丙肝2例，自身免疫性肝病1例，無肝炎、自身免疫性肝病的病例2例。

1.2 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)患者的病理分化程度，比較不同分化程度肝癌患者的CK19、CD34、p53、GPC3表達(dá)情況。分析患者肝臟CT平掃+增強(qiáng)掃描的表現(xiàn)，肝組織的三期動(dòng)脈CT值及病灶有無包膜、有無邊界、是否均勻強(qiáng)化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，TNM分期情況。比較不同甲胎蛋白水平的腫瘤分化程度。

1.3 檢查方法

1.3.1 病理組織免疫組化檢查 肝癌組織常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，采用鏈霉素親生物素-過氧化物酶法檢測CK19、CD34、GPC3、P53、Ki-67 的表達(dá)水平。將 CD34、p53、GPC3、CK19表達(dá)分為-至+++，其中-表示陰性，+-表示弱陽性，+、++、+++均表示陽性。Ki-67表達(dá)范圍為0～0.90，本研究所表達(dá)數(shù)值分別涵蓋0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90。肝癌的分化程度分為低分化、低中分化、中分化、中高分化、高分化。

1.3.2 CT掃描 采用GE lightspeed VCT 64層螺旋CT機(jī)進(jìn)行CT平掃+增強(qiáng)掃描。探測器寬度40 mm（0.625 mm×64層），管電流為380 mA，管電壓為120 kV，層厚為5 mm，層間距為5 mm；重組層厚為0.625 mm，層間距為0.625 mm。增強(qiáng)掃描：高壓注射器經(jīng)肘前靜脈注入碘普胺（370 mgI/ml）100 ml，流速為3 ml/s；動(dòng)脈期掃描20～25 s，門脈期掃描65～70 s，延遲期掃描3 min；測量時(shí)盡量覆蓋全部病灶范圍，避開血管、膽管、腫瘤壞死區(qū)域。分別測量感興趣區(qū)和腫瘤周圍正常肝組織的三期動(dòng)脈CT值。記錄病灶有無包膜、有無邊界、是否均勻強(qiáng)化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況及TNM分期情況[2]。

1.3.3 甲胎蛋白檢測 收集本研究40例患者于檢驗(yàn)科檢查所得的甲胎蛋白值數(shù)據(jù)。甲胎蛋白＜200 ng/ml，為正常或輕度升高；甲胎蛋白為200～400 ng/ml，為中度升高；甲胎蛋白＞400 ng/ml，為重度升高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分化程度

40例肝癌患者中，低分化占30%（12/40），中低分化占10%（4/40），中分化占50%（20/40），中高分化占0%（0/40），高分化占10%（4/40）。

2.2 不同分化程度肝癌患者的CK19、CD34、p53、Ki-67、GPC3表達(dá)情況

12例低分化患者的CK19表達(dá)：-7例，+-1例，+4例；4例低中分化：-1例，+-2例，+1例；20例中分化：-18例，+2例；4例高分化：-3例，+1例。不同分化程度肝癌患者的CK19表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.658，P=0.034）；而不同分化程度肝癌患者的CD34、p53、GPC3表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.055、4.048、3.182，P＞0.05）（表1）。低分化、低中分化、中分化、中高分化、高分化患者Ki-67表達(dá)的中位數(shù)分別為0.60（0.60～0.90）、0.80（0.20～0.80）、0.80（0～0.90）、0（0）、0.05（0.05～0.70），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.856，P＞0.05）；低分化、低中分化、中分化、中高分化、高分化患者Ki-67表達(dá)的眾數(shù)分別為0.60、0.80、0.80、0、0.05。Spearman相關(guān)性分析顯示，肝癌的分化程度與Ki-67表達(dá)眾數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.344，P=0.030）。

表1 不同分化程度肝癌患者的CK19、CD34、p53、GPC3表達(dá)情況

2.3 CT平掃和增強(qiáng)掃描的表現(xiàn)

平掃：40例患者中1例為高密度（低分化），39例為低密度（低分化例11，中低分化4例，中分化20例，高分化4例）。增強(qiáng)掃描：動(dòng)脈期掃描，肝組織均有強(qiáng)化；門脈期掃描，等密度1例（低分化），高密度1例（中分化），低密度38例（低分化11例，中低分化4例，中分化19例，高分化4例）；延遲期掃描，低密度39例（低分化12例，中低分化4例，中分化19例，高分化4例），高密度1例（中分化）。病灶門脈期掃描的CT值高于動(dòng)脈期的患者：低分化4例，中低分化2例，中分化10例，高分化1例；病灶門脈期掃描的CT值高于動(dòng)脈期的患者病灶門脈期掃描的平均CT值為（93.85±12.60）HU，明顯高于動(dòng)脈期的（79.21±23.45）HU，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.478，P=0.001）。病灶門脈期掃描的CT值低于動(dòng)脈期的患者：低分化8例，中低分化2例，中分化10例，高分化3例；病灶門脈期掃描的CT值低于動(dòng)脈期的患者病灶門脈期掃描的平均CT值為（83.19±10.53）HU，低于動(dòng)脈期的（88.6±12.64）HU，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.080，P=0.041）。病灶門脈期掃描CT值高于動(dòng)脈期的患者與病灶門脈期掃描CT值低于動(dòng)脈期的患者的低分化、中低分化、中分化、高分化的例數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.297，P=0.787）。低分化、中低分化、中分化、高分化患者病灶有包膜的例數(shù)分別為3例、1例、7例、1例，無包膜的例數(shù)分別為9例、3例、13例、3例，兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.385，P=0.738）。低分化、中低分化、中分化、高分化患者病灶無邊界的例數(shù)分別為9例、2例、9例、1例，有邊界的例數(shù)分別為3例、2例、11例、3例，兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.943，P=0.074）。低分化、中低分化、中分化、高分化患者均勻強(qiáng)化的例數(shù)分別為0例、1例、4例、4例，不均勻強(qiáng)化的例數(shù)分別為12例、3例、16例、0例，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.168，P=0.002）。

2.4 TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況

TNM分期：Ⅰ期24例（低分化8例，中分化12例，高分化4例），Ⅱ期3例（中分化1例，中低分化2例），Ⅲa期8例（低分化1例，中低分化1例，中分化6例），Ⅲc期1例（低分化），Ⅳa期1例（中低分化），Ⅳb期3例（中分化1，低分化2例）。不同TNM分期患者的腫瘤分化程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.275，P=0.513）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2例：中低分化1例，中分化1例。腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移3例：低分化2例，中分化1例。

2.5 不同甲胎蛋白水平患者的分化程度比較

16例患者的甲胎蛋白水平＜200 ng/ml，其分化程度為低分化3例、中低分化2例、中分化7例、高分化4例；6例患者的甲胎蛋白水平為200～400 ng/ml，其分化程度為低分化2例、中分化4例；18例甲胎蛋白水平＞400 ng/ml，其分化程度為低分化7例、中低分化2例、中分化9例。不同甲胎蛋白水平患者的分化程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.908，P=0.052）。

3 討論

CK19屬于膽管細(xì)胞型細(xì)胞角質(zhì)素，一般認(rèn)為肝細(xì)胞不表達(dá)CK19[3]。本研究結(jié)果顯示，CK19表達(dá)為+的患者腫瘤分化程度較低，推測CK19陽性表達(dá)與預(yù)后不好有關(guān)。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[4]。此外，研究顯示，CK19表達(dá)與腫瘤侵襲密切相關(guān)[5]。

本研究顯示，CT掃描時(shí)不同分化程度的肝癌病灶強(qiáng)化的均勻程度有差別。這可能是分化程度低的病灶生長快及自發(fā)壞死等原因?qū)е铝瞬≡顝?qiáng)化不均勻。

Ki-67抗原是一種增殖細(xì)胞標(biāo)志抗原，其表達(dá)隨細(xì)胞周期的不同而發(fā)生改變。Ki-67出現(xiàn)在G1中期至晚期，S期和G2期逐漸增加，M期達(dá)到最高值，G0期細(xì)胞不表達(dá)。Ki-67抗原與多種腫瘤細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期以及腫瘤的生長方式、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為相關(guān)。本研究中，雖然不同分化程度的Ki-67表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但分析40例患者的Ki-67抗原表達(dá)結(jié)果可見：低分化患者的Ki-67表達(dá)眾數(shù)為0.6，低中分化為0.8，中分化為0.8，高分化為0.05。Spearman相關(guān)性分析顯示，肝癌的分化程度與Ki-67表達(dá)眾數(shù)呈負(fù)相關(guān)。Ki-67表達(dá)越弱，該病灶的分化程度高；反之，分化越低，Ki-67表達(dá)越強(qiáng)[6]。

CD34在癌旁及正常肝組織肝竇處無陽性表達(dá)；在癌組織中呈陽性表達(dá)，陽性染色局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈條狀或環(huán)狀，彌漫分布[7]。本研究顯示，不同分化程度患者的CD34表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），該結(jié)果與其他學(xué)者提出的觀點(diǎn)不一致。有學(xué)者提出，CD34高表達(dá)，肝癌分化程度低，可作為肝癌預(yù)后的預(yù)測因子，其機(jī)制在于CD34可預(yù)示微血管受侵情況，其陽性程度越高，越支持微血管受侵，腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性隨之升高，直接影響患者的治療及預(yù)后[8]。

有學(xué)者提出，肝癌的病理分化程度與延遲期病灶密度負(fù)相關(guān)，延遲期病灶密度越高，病理分化程度越低[9]。與其他學(xué)者得出的“分化差的腫瘤廓清較早”的結(jié)論[10]相反。本研究中病灶門脈期掃描CT值高于動(dòng)脈期的患者與病灶門脈期掃描CT值低于動(dòng)脈期的患者的低分化、中低分化、中分化、高分化的例數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），推測肝癌患者的CT值（病灶密度）可能與分化程度無關(guān)。這與上述研究結(jié)論不一致，考慮與本研究中等密度病例太少有關(guān)，可能存在偏倚。

本研究中不同分化程度患者的p53、GPC3的表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同分化程度患者病灶有無包膜、有無邊界情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究有待進(jìn)一步補(bǔ)充病例，增加樣本量及分層分析將有助于得到更科學(xué)的結(jié)論，但即便是小樣本，也同樣為臨床研究提供一定的啟發(fā)。