類癌組織與癌旁組織中CD68、CD8、CD20表達(dá)的相關(guān)研究

吳娜娜，李昌林，王永生

1成都市第一人民醫(yī)院腫瘤科，成都 610041

2四川大學(xué)華西醫(yī)院胸部腫瘤科，成都 610041

類癌較少見，是生長(zhǎng)緩慢且惡性程度較低的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，起源于胚胎的原始腸道部分。類癌細(xì)胞內(nèi)含有親銀性分泌顆粒，故又稱為親銀細(xì)胞癌或嗜銀細(xì)胞癌。類癌主要發(fā)生于胃腸道，不同部位類癌臨床預(yù)后差異大。腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)共同組成的腫瘤微環(huán)境，在腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展中發(fā)揮非常重要的作用[1-2]，其中免疫細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)微環(huán)境的重要組分[3]。腫瘤微環(huán)境的免疫系統(tǒng)如何影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展一直是腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，尚無對(duì)類癌免疫微環(huán)境的相關(guān)研究。

CD8是細(xì)胞毒性T細(xì)胞的主要表面標(biāo)志，CD68是單核/巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志。巨噬細(xì)胞主要可分為M1型即經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞和M2型即替代性活化巨噬細(xì)胞。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá)和活性可用于鑒別M1型巨噬細(xì)胞和精氨酸酶1（arginase 1，ARG1）。ARG1是M2型巨噬細(xì)胞理想的表型標(biāo)志物。CD20是B細(xì)胞膜上特有的跨膜蛋白，在所有成熟B淋巴細(xì)胞（不包括漿細(xì)胞）膜上均呈陽(yáng)性表達(dá)。本研究通過免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)CD8、CD68、CD20的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)，以了解其分布規(guī)律和類癌腫瘤微環(huán)境，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2008—2012年在四川大學(xué)華西醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的類癌患者的病理標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)為類癌；②有原發(fā)病灶病理標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤的患者。依據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入13例類癌患者，其中原發(fā)于肺部6例，縱隔5例，闌尾2例。

1.2 主要試劑

主要試劑包括鼠抗人CD68單克隆抗體、兔抗人CD8單克隆抗體、兔抗人CD20單克隆抗體、一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測(cè)試劑盒、ARG1檢測(cè)試劑盒、PV-9003試劑盒和SP-9002試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 標(biāo)本處理

所有納入的病理標(biāo)本均經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色確定病變部位及癌旁正常組織后，在組織切片和相應(yīng)石蠟組織塊上標(biāo)記，并在空白石蠟塊上鉆孔，孔徑與空心管內(nèi)徑一致（均為1.5 mm），然后用金屬空心管從經(jīng)定位的目標(biāo)石蠟塊上鉆取組織，并轉(zhuǎn)移至已鉆孔的空白石蠟塊的相應(yīng)位置。每個(gè)選中石蠟塊（包括原發(fā)灶腫瘤組織和癌旁正常對(duì)照組織）選3～4個(gè)組織放入芯片中。連續(xù)切片后，將切下的4 μm厚的組織裱于經(jīng)防脫片處理的載玻片上，置于56℃烤箱中烘烤72 h，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)方法

采用標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法對(duì)CD68進(jìn)行染色，CD8和CD20采用第二代聚合酶兩步法（PV法）染色，NO檢測(cè)采用iNOS試劑盒、ARG1檢測(cè)采用ARG1試劑盒，根據(jù)說明書嚴(yán)格操作。檢測(cè)上述標(biāo)本連續(xù)切片中CD68、CD8、CD20、iNOS和ARG1的表達(dá)情況。設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，以試劑公司提供的已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。免疫組化染色后，在400倍的顯微鏡視野下，腫瘤內(nèi)外各選取5個(gè)染色均勻的非連續(xù)視野，每個(gè)視野約0.1 mm2，數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.5 觀察指標(biāo)和評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

在不查看患者臨床資料的情況下，由同一研究者對(duì)每個(gè)視野進(jìn)行兩次細(xì)胞計(jì)數(shù)。同時(shí)使用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，得到陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和積分光密度（integral optical density，IOD）值，IOD=平均光密度×測(cè)量面積。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

分析13例類癌患者的病理標(biāo)本，類癌組織中CD68陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)為（3.186±0.936），明顯高于癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)（2.254±0.913），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.253，P=0.009）（圖1）。類癌組織中CD8陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1.939±1.060），低于癌旁組織的（2.089±0.958），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.154，P=0.278）。CD20在類癌組織或癌旁組織中均無明顯表達(dá)。類癌組織中iNOS表達(dá)的IOD為30.29（10.91，47.05），高于ARG1表達(dá)的 IOD 1.83（1.51，2.59），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.872，P=0.061）。

圖1 CD68在類癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

1888年，回腸類癌首次被報(bào)道[4]；1929年，Siegfried Oberndorfer發(fā)文更正了1907年發(fā)表的認(rèn)為類癌是惡性病變，可發(fā)生轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)[5]。類癌生長(zhǎng)緩慢，自然病程長(zhǎng)，多發(fā)生于消化道（50.00%），包括小腸（28.54%）、直腸（13.61%）和胃（4.61%），其次多見于肺和支氣管[6]。類癌可分泌多種生物活性物質(zhì)（5-羥色胺、血管舒張素、組胺和生長(zhǎng)抑素等），進(jìn)入血液后可出現(xiàn)面部和軀干上部潮紅或紫紅、腹部絞痛、腹瀉、哮喘和呼吸困難，后期可出現(xiàn)右心衰竭、心內(nèi)膜下纖維化和繼發(fā)性瓣膜功能不全，以及心包炎伴滲出等，統(tǒng)稱為類癌綜合征。類癌對(duì)放化療不敏感，治療以手術(shù)為主。Modlin等[6]研究顯示，不同部位類癌臨床預(yù)后差異大：5年生存率最高的是直腸類癌（88.3%），其次為闌尾類癌（71.0%）、胃類癌（63.0%）和結(jié)腸類癌（61.8%），小腸類癌最低（60.5%）。本研究旨在進(jìn)一步了解不同原發(fā)部位類癌組織及癌旁組織內(nèi)環(huán)境差異，為類癌治療提供依據(jù)。

巨噬細(xì)胞是腫瘤炎性浸潤(rùn)的主要成分[7-8]，根據(jù)活化狀態(tài)及發(fā)揮功能的不同分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞通過分泌促炎性細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）、IL-23、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1、IL-6、iNOS]和趨化因子[CXC趨化因子配體10（CXC chemokine ligand-10，CX-CL10）]，參與正向免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。M2型巨噬細(xì)胞僅有較弱的抗原提呈能力，其通過分泌抑制性細(xì)胞因子ARG1、IL-10和（或）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）等下調(diào)免疫應(yīng)答，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8-10]。

部分巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)于腫瘤組織間質(zhì)，構(gòu)成腫瘤賴以生長(zhǎng)的間質(zhì)微環(huán)境，被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM），與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。TAM可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，刺激腫瘤血管生成和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，還可以通過分泌IL-10等免疫抑制因子，抑制淋巴細(xì)胞活性，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫耐受。卵巢癌和肝癌等相關(guān)研究指出，TAM數(shù)量與患者預(yù)后呈正相關(guān)[11-12]，而在乳腺癌、肺癌和前列腺癌的研究中與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性[13-15]。目前，尚無類癌與TAM預(yù)后的相關(guān)性研究。由于類癌屬于少見病，各部位樣本量太少，可能導(dǎo)致結(jié)果偏差，本研究未對(duì)不同部位CD68陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，也未行預(yù)后相關(guān)性分析。

巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性可能是TAM在預(yù)后中作用爭(zhēng)議的原因。本研究發(fā)現(xiàn)，類癌組織中iNOS表達(dá)IOD水平高于ARG1，即類癌組織中M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)高于M2型巨噬細(xì)胞，但可能由于樣本量小，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.061）。表明類癌腫瘤組織微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的正向免疫應(yīng)答途徑強(qiáng)于負(fù)向免疫下調(diào)途徑，這可能是類癌腫瘤生長(zhǎng)緩慢和惡性程度低的原因。因此，類癌臨床治療中，針對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫治療是否能有效預(yù)防轉(zhuǎn)移及延緩腫瘤進(jìn)展值得進(jìn)一步探討。尚需進(jìn)一步隨訪和分析腫瘤相關(guān)M1型巨噬細(xì)胞是否與患者的生存相關(guān)。