GPRC5A抑制肺癌細胞A549增殖和遷移及與EGFR的相關性研究

黃華奇 聞劍波 江明君 石世青 趙子恩 黃科峰 葛建軍 戚賽春

肺癌是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。僅在2013年，全國肺癌新發病例約73.28萬例，死亡病例約58.07萬例[1]。大多數患者發現時已處于晚期，5年生存率低于15%[2-3]。非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）約占所有肺癌的80%。G蛋白偶聯受體 C 家族 5A（G protein-coupled receptor，GPRC5A）是一種由全反式維甲酸誘導的基因，也稱為維甲酸誘導蛋白 3（retinoic acid-induced 3，RAI3）。Tao 等[4]敲除小鼠GPRC5A基因導致肺癌發生，同時他們還發現，肺癌組織的GPRC5A的表達水平相較于鄰近的癌旁組織低。肺癌分子靶向藥物中，最受矚目的是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。Siegelin 等[5]發現，EGFR在超過60%的轉移性NSCLC中高表達，且與不良預后相關。本研究探討GPRC5A基因對人肺癌細胞A549增殖和遷移能力的影響及其與EGFR的相關性，現將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要細胞、試劑和培養液 A549細胞購自中科院上海生命科學研究所；真核表達載體pLenti6.3-MCS購自上海諾百生物科技有限公司；DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；DMEM培養基、胰酶、吐溫-20及新生FBS購自美國Hyclone公司；Lipofectamine 2000轉染 試 劑 、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase、SYBR GreenⅠ購自美國Invitrogen公司；OBIO cell count kit（CCK-8）購自和元生物技術（上海）股份有限公司；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒 (增強型)購自上海碧云天生物技術有限公司；Tanswell plate購自美國Corning Costar公司；單克隆抗體GPRC5A、EGFR購自美國Santa Cruz公司。

1.2 pLenti6.3-MCS-GPRC5A質粒的構建和鑒定 通過美國國家生物技術信息中心檢索，查出人GPRC5A的mRNA序列（NM_003979.3），設計特異性引物（酶切位點（Nhe I/Asc I）；擴增引物 F：5′-GCTAGC ATGGC TACAA CAGTC CCTGA TGG-3 ′；R：5 ′-GGCGCGCC TTAGE TGCCC TCTTT CTTTA CTTCA TAGT-3′） 進行PCR擴增，重組到載體pLenti6.3-MCS中，并測序驗證。PCR 擴增條件為：94℃預熱 2min，94℃變性30s，60 ℃退火40s，72℃延伸1min，變性至延伸共進行30個循環，72℃最終延伸10min。用NheⅠ、AscⅠ內切酶分別雙酶切PCR擴增產物和pLenti6.3-MCS，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收試劑盒回收目的片段，在T4 DNA連接酶作用下，16℃連接過夜，轉化DH5a感受態細胞，篩選Amp抗性的完全落單的菌落，PCR鑒定測序，命名為pLenti6.3-MCS-GPRC5A。

1.3 細胞轉染和陽性克隆篩選 選擇狀態良好的處于對數生長期的A549細胞制成細胞懸液，接種至24孔板中。37℃培養過夜，使細胞融合至70%密度。實驗開始前，更換無血清Opti-MEM培養基。根據轉染試劑說明書分別將pLenti6.3-MCS-GPRC5A、pLenti6.3-MCS質粒與Lipofectamine 2000按照合適比例轉染至A549細胞。轉染4～6h后，更換DMEM完全培養基。48h后，將轉染細胞按1∶4傳代，繼續培養24h，換含新霉素400μg/ml的培養液篩選2周。挑取單細胞陽性克隆繼續在含新霉素200μg/ml的培養液中擴大培養。轉染pLenti6.3-MCS-GPRC5A質粒的細胞命名為A549-GPRC5A，轉染pLenti6.3-MCS質粒的細胞命名為A549-NC。

1.4 GPRC5A和EGFR mRNA檢測表達情況 采用實時熒光定量-逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術檢測靶基因的表達。先利用TRIzol法提取各組細胞的總RNA，然后反轉錄合成cDNA，根據SYBR GreenⅠ說明書要求配制反應體系，采用美國Bio-Rad熒光定量PCR儀（CFX96TMReal-Time Systerm）進行qRT-PCR檢測，以 β 肌動蛋白（β-actin）為內參，采用 2-ΔΔCt法比較A549-GPRC5A和A549-NC細胞中GPRC5A和EGFR mRNA的表達水平。GPRC5A引物為 F∶5′-GCTGC TCACA AAGCA ACGAA-3′，R∶5′-ATAGAGCGTGTCCCCTGTCT-3 ′；EGFR 引 物 為 F∶5 ′-CAGAT GGATG TGAAC CCCGA，R∶5′-TTCTT ACACT TGCGG ACGCC。

1.5 GPRC5A和EGFR蛋白表達情況檢測 采用Western blot方法檢測靶蛋白的表達。收集細胞，加入RIPA細胞裂解液，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。樣品加入5×蛋白上樣緩沖液混合，煮沸5min，取20μg蛋白上樣。聚丙烯酰胺凝膠先90V跑完積層膠，再將電壓升至200V直到電泳結束。取下凝膠進行轉膜，恒壓100V轉膜。取下膜，先用含有吐溫-20的PBS溶液（PBST）洗滌4次，每次5min。將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉37℃1h。用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中4℃過夜。次日將膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min，用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37℃反應1h。反應完畢后，將膜取出置于干凈的盒子中洗膜4次，每次5min。電化學發光法顯影、曝光。利用Image J軟件分析WB條帶的灰度值。

1.6 A549細胞增殖情況檢測 采用CCK-8法，取兩組對數生長期細胞，按每孔3000個細胞接種于96孔培養板，每組設5個平行孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養。分別于 24、48、72h 后，在每孔中加 10μl的 CCK-8，繼續培養2h后，用酶標儀在450nm處測OD值，取5個孔的平均值，比較兩組細胞在各時間點增殖速度的變化和GPRC5A對A549細胞的增殖抑制效果。

1.7 A549細胞遷移能力檢測 采用Transwell方法，首先把含8μm孔徑PET膜的Transwell小室放置在無血清DMEM培養基中，37℃平衡30min，準備待用。取對數生長期的各組細胞，分別用無血清的培養基制成細胞懸液，細胞密度調整為1E5/ml。Transwell培養板下室加入800μl含血清的完全培養基，上室加入200μl細胞懸液。于37℃，5%CO2培養箱中培養24h。取出Transwell小室，用棉簽擦去膜靠近內室上層的細胞，下層細胞用4%多聚甲醛固定30min，1%結晶紫染色10min，用清水洗3遍以上。顯微鏡下觀察，利用ipwin32軟件計數。

1.8 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件,符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pLenti6.3-MCS-GPRC5A質粒酶切鑒定結果 3、4泳道顯示的兩條帶大小分別為8.9kb和1kb，與pLenti6.3-MCS-GPRC5A的大小一致（圖1）。pLenti6.3-MCS-GPRC5A陽性重組克隆子的測序結果與標準的GPRC5A基因mRNA序列完全相同，說明pLenti6.3-MCS-GPRC5A真核表達載體構建成功。

圖1 pLenti6.3-MCS-GPRC5A質粒酶切鑒定結果（1：DL10000 DNA Marker；2：環狀 pLenti6.3-MCS-GPRC5A 質粒；3：pLenti6.3-MCS質粒；4：GPRC5A片段）

2.2 兩組細胞GPRC5A、EGFR mRNA和蛋白表達情況的比較見表1。

表1 兩組細胞GPRC5A、EGFR mRNA和蛋白表達情況的比較

由表1可見，與A549-NC細胞比較，A549-GPRC5A細胞GPRC5A mRNA和蛋白的表達量明顯上升，EGFR mRNA和蛋白的表達顯著降低。Western blot檢測靶蛋白的電泳圖見圖2。

圖2 兩組細胞GPRC5A和EGFR蛋白表達的電泳圖

由圖2可見，與A549-NC細胞比較，A549-GPRC5A細胞GPRC5A電泳條帶明顯變粗，EGFR電泳條帶顯著變細。

2.3 兩組細胞各時點的增殖情況見表2。

表2 兩組細胞各時點增殖情況（OD值）

由表2可見，與A549-NC細胞比較，A549-GPRC5A細胞同一時間段內的OD值均較低，其中24、48和72h的差異有統計學意義（均P＜0.05）。進一步分析發現，GPRC5A細胞對A549細胞增殖抑制率在24、48、72h分別為22.34%、31.28%、33.52%。

2.4 兩組細胞遷移能力比較 A549-GPRC5A細胞和A549-NC細胞遷移的數目分別為（453.0±21.20）個和（751.0±18.36）個。與A549-NC細胞相比，A549-GPRC-5A細胞遷移數目顯著減少，表明GPRC5A對A549細胞的遷移有抑制作用。兩組細胞遷移情況見圖3。

圖 3 兩組細胞遷移情況（a：A549-GPRC5A；b：A549-NC；結晶紫染色法，×100）

3 討論

近年來，國內外學者對NSCLC分子機制的大量研究發現，肺癌發生過程中存在許多起關鍵性作用的遺傳突變——驅動型突變[6]，肺癌的發生或維持離不開這些突變。其中，EGFR發生了最明顯的激活突變。磷酸化的EGFR激活下游 RAS/RAF/MEK/MAPK，PI3K/AKT和JAK/STAT等信號通路[7]。這些通路對于細胞的生長增殖、轉移侵襲、抑制促凋亡蛋白等功能發揮著重要作用。現階段，NSCLC中EGFR靶向治療藥物的研發仍是熱點。

G蛋白偶聯受體是人體內最大藥物靶標蛋白質超家族，目前已報道了約2000種不同的GPCRs[8]。GPRC5A是GPCRs C型家族中的一員，定位于染色體12p12.3-p13區域，它包含的7個α螺旋跨膜結構域是抑制EGFR活性所必須的。自1998年GPRC5A基因在人頭頸鱗狀細胞癌細胞株UMSCC-22B中被發現后，眾多學者對其功能進行探究。GPRC5A被發現主要在肺組織表達[4,9-10]，在其他組織中低表達或者不表達，表明其在肺組織中有著特殊的作用。在肺腫瘤細胞或組織中，GPRC5A表達被抑制或者敲除后，EGFR、STAT3、NF-κB、cAMP等多個信號通路被過度激活[11-14]，對肺腫瘤發生起著非常重要的作用。GPRC5A在調控cAMP的過程中存在一個負反饋的環路，過表達GPRC5A被發現能夠降低細胞內cAMP的水平[14]。cAMP通路的活化在許多腫瘤細胞的增殖、侵襲等活動中發揮著重要作用，能夠促進酪氨酸磷酸化，顯著地反式激活EGFR[15]。體內激活的EGFR通過催化GPRC5A羧基端酪氨酸殘基Y317/320和Y347/350發生磷酸化，與GPRC5A基因進行互作[16]。鐘霜霜等[17]表明，STAT3是EGFR下游的信號通路，GPRC5A-/-（敲除型）小鼠氣管上皮細胞和肺組織中EGFR-STAT3信號通路發生過度激活，且在人肺癌細胞系中過表達GPRC5A能夠抑制EGFR信號通路的激活。Chen等[12]研究發現GPRC5A-/-小鼠肺上皮細胞中STAT3的磷酸化水平較高且持續性激活，其調控的BCL-XL、Cryab等抗凋亡基因的表達水平都較高。在肺癌、肝癌等多種腫瘤中，磷酸化的EGFR可以通過IKK激酶復合物激活NF-κB，進而給癌細胞傳遞致癌信號[18]。Deng等[13]研究發現，GPRC5A-/-小鼠的肺上皮細胞中NF-κB的活性加強，導致細胞自主性增高，炎性反應增強，最終協同產生促進腫瘤發生的微環境。上述研究表明，GPRC5A與肺癌細胞多個通路存在關聯，其發揮功能最主要的途徑是抑制EGFR通路的激活。

現今有關GPRC5A與EGFR相關性的報道較少，GPRC5A對肺癌細胞的生物學行為和功能需要進一步研究。GPRC5A與EGFR通路的關聯需要更多的實驗進一步挖掘，GPRC5A能否通過其他未研究的通路對肺癌細胞造成影響也需要探究發現。本實驗的目的是了解GPRC5A對肺癌細胞A549的影響并且探討其與EGFR通路的相關性。本研究發現，過表達GPRC5A后，A549細胞中EGFR mRNA和蛋白的表達量顯著下降，細胞的生長增殖受到明顯抑制，遷移能力減弱，表明GPRC5A可能通過抑制EGFR通路的激活對細胞的功能產生影響。這些研究為更好地了解GPRC5A在肺癌細胞內的生物學功能提供了實驗依據，也為深入探討GPRC5A和EGFR的相互作用奠定了一定基礎。