長(zhǎng)針線蟲Longidorus pinus的形態(tài)和分子鑒定

樊金玲，徐玉梅，趙增旗,2，王建明

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.新西蘭皇家研究院土地環(huán)境研究所，新西蘭奧克蘭1072）

長(zhǎng)針線蟲屬（Longidorus Micoletzky，1922）寄生在植物根際，不僅會(huì)造成植物根部腫大、生長(zhǎng)不良，而且還會(huì)傳播植物病毒，引起果蔬病害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成產(chǎn)量損失[1]。因其具有種類多樣性以及分布廣泛等特點(diǎn)被研究人員廣泛關(guān)注[2]。目前，該屬全世界已報(bào)道的有160多種，其中，我國(guó)報(bào)道的有20種[2-11]。

本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)（包括18S和28S的分子序列）相結(jié)合的鑒定方法，對(duì)采自山西介休的棗樹根際土壤中的線蟲進(jìn)行種類鑒定，以明確該線蟲的分類地位。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

試驗(yàn)材料采自山西省介休市（112°10′14″E，36°50′01″N），取棗樹根際土壤樣本 1 000 g，編號(hào)JX10，裝入封口袋中，做好標(biāo)記帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 線蟲標(biāo)本的分離、制片和形態(tài)觀察 采用淺盤法分離線蟲[12]，應(yīng)用改進(jìn)的SEINHORST[13]方法脫水，將固定脫水的線蟲采用改進(jìn)的HOOPER[14]方法制成永久玻片，并將制好的永久玻片置于Nikon 80i顯微鏡下進(jìn)行觀察，用尼康Ds-Fi2拍照，用NIS Elements version 4.10軟件測(cè)量形態(tài)并利用de Man公式計(jì)算測(cè)量指標(biāo)a，b，c，c'和V，具體方法參照文獻(xiàn)[15-16]。

1.2.2 線蟲的DNA提取、PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 取單頭線蟲采用改進(jìn)的蛋白酶K裂解法提取DNA[17]。18S采用2對(duì)引物擴(kuò)增，第1對(duì)的上、下游引物分別為：1096F（5′-GGTAATTCTGGAGCTA ATAC-3′），1912R（5′-TTTACGGTCAGAACTAGG G-3′）；第 2 對(duì)的上、下游引物分別為：1813F（5′-CT GCGTGAGGTGAAAT-3′），2646R（5′-GCTACCTTGT TACGACTTTT-3′）。28S的上、下游引物分別為：D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3′），D3B（5′-T GCGAAGGAACCAGCTACTA-3′）。PCR 擴(kuò)增程序：95℃ 2.75 min；95℃ 1 min，53℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃7 min。采用XU等[18]的方法進(jìn)行產(chǎn)物純化，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Sequencher 5.1.2編輯拼接，并用Mrbays 3.1.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

其測(cè)量結(jié)果列于表1。

表1 供試線蟲及其比較種群形態(tài)測(cè)量計(jì)值 μm

雌蟲（圖1-A～H）：蟲體熱殺死后呈J型或C型，體長(zhǎng) 3 480～4 366 μm，唇寬 10.5～11.3 μm，明顯縊縮。齒尖針纖細(xì)，69.8～81.7 μm，齒托基部微腫脹，導(dǎo)環(huán)距頭前端30.6～33.6 μm。神經(jīng)環(huán)到頭前端的距離195～248μm，食道球圓柱形（（67～79）μm×（14～17）μm），陰門處體寬 27.3～36.1 μm，尾部圓錐形，尾長(zhǎng) 32.3～41.5 μm（表 1）。

幼蟲（圖1-I～L）：僅發(fā)現(xiàn)1齡幼蟲1頭，除個(gè)體大小和生殖器官外，與雌蟲均相似。蟲體熱殺死后呈 J型或 C型，體長(zhǎng) 1 176 μm，口針 43.8 μm，替代口針52.2 μm，替代口針前端插入齒托內(nèi)部。尾短，圓錐形，尾長(zhǎng) 17.6 μm（表 1）。

未發(fā)現(xiàn)雄蟲。

2.2 分子生物學(xué)特征分析

本試驗(yàn)種群對(duì)18S和28S測(cè)序分別獲得1 559，746 bp，將其與NCBI中已有的序列進(jìn)行了比對(duì)，其結(jié)果表明，18S序列相似度最高的是Longidorus（MF674014和MF674015），與MF674014相似率為99%（1 559 bp有1 bp空白差異），與MF674015相似率為100%（圖2）。28S序列相似度最高的是Longidorus（MF674016～MF674019），與 4 條序列的相似率均為99%（圖3）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

以 Paralongidoruslitoralis和 Paralongidorus paramaximus為外群，用GTR＋I(xiàn)模型構(gòu)建的18S系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。本試驗(yàn)種群JX10與Longidorus pinus（MF674015 和 MF674014）在同一分枝上，置信度達(dá)100%。

以Paralongidorus maximus和Paralongidorus plesioepimikis為外群，用GTR＋G模型構(gòu)建的28S系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。本試驗(yàn)種群JX10與Longidorus pinus（MF674016～MF674019）在同一分枝上，置信度達(dá)96%。

2.4 鑒定結(jié)果

綜合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)分析結(jié)果，將JX10鑒定為松樹長(zhǎng)針線蟲Longidorus pinus。依照CHEN等[19]和PENEVA等[20]的多歧檢索表，確定其鑒定代碼為A23-B1-C23-D4-E1-F2-G23-H23-I1-J2-K6。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，采用18S和28S區(qū)的分子序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法，將山西介休棗樹根際土壤中分離的長(zhǎng)針屬線蟲鑒定為L(zhǎng)ongidorus pinus。與XU等[3]標(biāo)本相比，本試驗(yàn)種群雌蟲的齒托較短（30.3～49.5 μm），尾部較長(zhǎng)（32.3～41.5 μm），XU等[3]標(biāo)本的齒托和尾長(zhǎng)分別為42.1～54.3，30.9～39.7 μm。可能是由于不同的地理種群造成的種內(nèi)差異。

松樹長(zhǎng)針線蟲Longidorus pinus首次于山西省汾陽(yáng)市、太谷北洸村、大同市平旺花園、太原市陽(yáng)曲縣和山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園等地發(fā)現(xiàn)，其寄主包括松樹、白蠟樹、玉米、槐樹和楊樹。棗樹為該線蟲的新寄主。