硼酸鈉經由非MyD88依賴 HepG2細胞表達IL-6

魏 英，陳琴華，武 倫，袁方均，周文波*

0 引言

肝細胞癌(HCC)是全球第5大常見和第3大致命腫瘤，嚴重威脅著人類健康。目前全球每年有超過50萬人被診斷為肝細胞癌，其發病率逐年增加[1]。盡管目前診斷和治療技術有所改進，但HCC的5年生存率仍然較低，約為15%(偏遠地區僅為2%)[2-3]。HCC為典型的炎癥相關性腫瘤，其發生、發展與白細胞介素6(IL-6)等關鍵炎癥因子有關，IL-6對HCC的發生、發展、侵襲和轉移起著重要的作用[4]。慢性肝臟炎癥時血清IL-6表達升高，而高濃度的IL-6增加HCC的發生率[5]。癌前病變和肝癌干細胞均能自分泌IL-6，這種自分泌的IL-6是肝癌進展的關鍵[6]。

硼(Boron)是一種非金屬元素，在自然界中含量較多，多以硼酸鈉(Borax)形式存在，世界衛生組織認為硼是人體的一種必需營養元素，近年來硼在腫瘤治療及預防方面越來越受重視。課題組在探討損傷相關的分子模式(DAMPs)對HepG2自分泌IL-6的影響時，偶然發現Borax上調HepG2細胞IL-6 mRNA表達，進一步研究發現，Borax可通過活化p53誘導HepG2細胞凋亡[7]，這種上調IL-6表達的同時又誘導肝癌細胞株凋亡的現象與目前眾多文獻報道IL-6與肝癌的關系不符，由此引起了我們的關注：Borax上調HepG2細胞IL-6 mRNA表達的機制是什么？本研究在前期基礎上用4.0 mmol/L Borax作用不同時間點的HepG2細胞，觀察Borax對HepG2細胞自分泌IL-6的影響，并應用siRNA基因干擾技術，沉默HepG2細胞的MyD88基因，探討Borax對HepG2細胞IL-6表達的影響與MyD88信號通路間的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑 人肝癌細胞株HepG2(武漢大學典型培養物保藏中心)；Borax(Sigma-Aldrich，221732)；RPMI-1640培養液(美國Gibco公司)；TRIzol Reagent(美國Incitrogen公司)；逆轉錄試劑(美國Fermentas公司)；ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司設計合成)；MyD88-RNAi基因沉默試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司)，轉染試劑(Therma DharmaFECT 4)。

1.2 主要實驗儀器 全波長酶標儀(美國Biotek公司)；CO2培養箱(法國Thermo公司)；熒光定量PCR儀Rotor Gene-6000(澳大利亞Rotor Gene公司)；全波段酶標儀(BioTEK INC，MQX-200)。

1.3 HepG2細胞的培養 用含10%胎牛血清的RPMI-l640培養液，在37 ℃、5% CO2條件下常規培養人肝癌細胞HepG2，當細胞覆蓋80%～90%瓶底后，用0.25%的胰酶-EDTA常規消化傳代，進行各項實驗。

1.4 MyD88基因siRNA干擾片段的篩選

1.4.1 siRNA的設計制備 在GenBank中查到人MyD88 mRNA序列(編號：NM_001172567.1)，選擇不同的部位設計了4對MyD88 siRNAs(序列見表1)，并經序列相似性軟件比對不與任何已知基因有同源性。MyD88 siRNAs由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。siRNA成品為已退火的凍干粉，使用前用DEPC水配制成20 μmol/L的工作母液。

1.4.2 脂質體介導MyD88 siRNA轉染HepG2細胞 在1 OD的siRNA中加入150 μl的DEPC水(公司配送)，得到20 μmol/L的siRNA母液。轉染前24 h將細胞接種至6孔板，待細胞長至75%左右進行轉染。取2個2.0 ml的EP管，管1取10 μl 20 μmol/L的siRNA加90 μl DEPC水，加100 μl無血清DMEM培養基，室溫孵育5 min；管2取4 μl DharmaFECT 4加196 μl無血清DMEM培養基，室溫孵育5 min。混合管1、管2，上下顛倒混勻，室溫孵育20 min。向上述混合液中加入1 600 μl含10% FBS的DMEM培養基，混勻后加入6孔板。設立空白對照組(Control)、陰性對照組(Negative)、轉染試劑組(Reagent)、MyD88-home-316(siRNA-1)、MyD88-home-760(siRNA-2)、MyD88-home-987(siRNA-3)、MyD88-home-1229(siRNA-4)組，各組設置3個復孔。

表1 MyD88 siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、IL-6和GAPDH正義、反義鏈引物序列

1.4.3 RT-PCR檢測轉染后MyD88 mRNA的表達情況 轉染24 h后，收集細胞，用RT-PCR方法檢測各試驗組MyD88 mRNA的表達，篩選出MyD88基因siRNA干擾片段。應用TRIzol Reagent總RNA抽提純化試劑盒抽提細胞總RNA，紫外分光光度計測定A260與A280比值在1.8～2.0范圍。應用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA。在稀釋至25 ng/μl的cDNA中加入SYBR ?GREEN PCR Master Mix和相應基因擴增引物(序列見表1)，進行RT-PCR檢測，反應條件：95 ℃，5 min；60 ℃，20 s；72 ℃，1 min，40個循環。以目的基因域循環數(Threshold cycle，Ct)值對同一樣本的內參照基因GAPDH Ct值進行目的基因表達的相對定量分析。

1.5 Barox對HepG2細胞IL-6表達的影響

1.5.1 RT-PCR法檢測IL-6 mRNA的表達 將1×105個/ml的HepG2細胞懸液接種于6孔板，每孔1 ml，0、4.0 mmol/L的Borax共孵育5、10、20、30 min，1、2、6、12、24、48、72 h，各組設置3個復孔，收集細胞，用RT-PCR方法檢測各試驗組IL-6 mRNA的表達情況。

1.5.2 ELISA法檢測細胞培養上清中IL-6的分泌量 將1×105個/ml的HepG2細胞懸液接種于6孔板，每孔1 ml，0、4.0 mmol/L Borax共孵育1、2、6、24、48、72 h，各組設置3個復孔，收集培養上清液。按照試劑說明書檢測細胞培養上清中IL-6蛋白的含量。

1.5.3 基因沉默技術觀察Barox上調HepG2細胞IL-6表達與MyD88間的關系 將1×105個/ml的HepG2細胞懸液接種于6孔板，每孔1 ml，細胞長至75%左右，用篩選出MyD88基因siRNA干擾片段轉染沉默MyD88基因。轉染24 h后，與4.0 mmol/L的Borax共孵育24 h。設空白對照組、siRNA組、4.0 mmol/L Borax組、siRNA+Borax組，各組設置3個復孔。收集細胞，用RT-PCR方法檢測各試驗組MyD88和IL-6 mRNA的表達情況，探明Barox上調HepG2細胞IL-6表達與MyD88間的關系。

2 結果

2.1 干擾片段的篩選 與對照組比較，轉染24 h后，干擾片段siRNA-1能有效沉默MyD88基因90%以上，干擾片段siRNA-4能有效沉默MyD88基因75%以上，其他干擾片段也能不同程度地沉默MyD88基因，本實驗選擇沉默效果最好的干擾片段siRNA-1做后續實驗。見圖1。

圖1 MyD88 siRNA干擾片段的篩選

2.2 Borax上調HepG2細胞IL-6 mRNA表達 Borax作用HepG2細胞5 min后，IL-6 mRNA表達即明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；隨著Borax作用時間的延長，IL-6 mRNA表達逐漸升高，作用24 h時，IL-6 mRNA表達到達高峰；繼續延長Borax作用時間，作用48 h和72 h時，IL-6 mRNA表達逐漸下降，但與對照組比較，IL-6 mRNA表達仍顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 Borax對HepG2細胞培養上清IL-6蛋白表達的影響 Borax作用HepG2細胞1 h后，細胞培養上清中IL-6蛋白即明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；隨著Borax作用時間的延長，IL-6蛋白表達逐漸升高，作用48 h時，IL-6蛋白表達到達高峰；繼續延長Borax作用時間至72 h時，IL-6蛋白較48 h下降，但與對照組比較，IL-6蛋白仍然高表達，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

圖2 Borax誘導對HepG2細胞IL-6 mRNA表達的影響

表2 Borax誘導HepG2細胞培養上清IL-6蛋白高表達

2.4 Barox上調HepG2細胞IL-6表達與MyD88間的關系 RT-PCR結果如圖3所示，Borax作用24 h對MyD88基因mRNA的表達無影響。干擾片段siRNA-1有效沉默MyD88基因后，加入Borax作用24 h，IL-6 mRNA表達仍顯著升高，與單一Borax處理組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 MyD88基因沉默后對Barox上調HepG2細胞IL-6 表達的影響

3 討論

HCC為典型的炎癥相關性腫瘤，其發生發展與IL-6、肝細胞生長因子(HGF)等關鍵炎癥因子有關[8]。IL-6與HCC的關系備受關注，特別是2007年Naugler等[9]證實了IL-6在促成小鼠肝細胞癌方面存在性別差異后，IL-6與肝癌的關系迅速引起了研究界的關注。在酒精性肝炎、乙肝、丙肝、脂肪肝等慢性肝臟炎癥時血清中的IL-6濃度增加，而高濃度的IL-6可能導致HCC的發生[5]。血清高水平IL-6預示著慢性乙肝患者將來可發展為HCC[10]。HCC患者血清中的IL-6水平比正常人高很多，三期肝癌患者比一期、二期患者的IL-6水平高很多[11]。目前已有很多學者提出可將循環中IL-6作為HCC的一種腫瘤標記物[12]。

硼在人類新陳代謝中起著重要作用，是生物系統完成生命周期必不可少的元素[13]。有報道，硼具有防治腫瘤的特性，硼的攝入量與一些癌癥的發生率呈負相關，提高飲食中硼的含量可降低前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌等的風險[14-16]。作為抗癌藥物，含硼化合物在不能手術的癌癥和高惡性腫瘤中的使用逐漸增加，其通過抑制絲氨酸蛋白酶、NADPH-脫氫酶、mRNA剪接、競爭性結合受體結合等多種機制，干擾腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞的凋亡。

硼在肝癌防治方面也有眾多進展，研究證實，硼通過抑制氧化應激反應改善暴發性肝衰竭的肝臟病理學變化[17]，通過抑制細胞核增殖抗原的表達抑制化學誘導大鼠肝癌的發生發展[18]，本課題組前期研究發現，硼誘導肝癌細胞株HepG2凋亡[7]。Borax在誘導HepG2凋亡的同時上調了IL-6的表達，體現了IL-6與肝癌關系的復雜性。追溯文獻發現，早在1999年，Kang等[19]就提出了不同的觀點：將IL-6的cDNA轉染到小鼠TIB細胞后移植到小鼠體內，前6周沒有生長，相反空轉對照細胞在接種后前3周生長飛快，提示IL-6對腫瘤的生長有抑制效應。

免疫細胞產生IL-6有3條主要通路，其中MyD88依賴途徑占主導地位。本課題應用基因沉默技術，分析Borax誘導HepG2細胞IL-6表達上調是否與MyD88依賴途徑有關。結果顯示，4 mmol/L Borax作用5 min后即誘導HepG2細胞高表達IL-6 mRNA，24 h達高峰，隨后逐漸降低；siRNA-316沉默MyD88后，對Borax誘導的HepG2細胞IL-6表達上調無影響。結果表明，Borax經由非MyD88依賴途徑誘導人肝癌HepG2細胞表達IL-6。

本課題為IL-6與肝癌關系的復雜性提供了實驗依據，即IL-6在肝癌的發生發展中可能起到了一把雙刃劍的作用，并且為更好地了解Borax的抗肝癌作用提供了研究基礎。總之，Borax經由非MyD88依賴途徑上調HepG2細胞表達IL-6，但Borax上調HepG2細胞IL-6表達的具體機制及Borax上調HepG2細胞IL-6表達與其誘導HepG2細胞凋亡的關系尚在進一步研究中。