柯薩奇B3病毒感染對HL-1心肌細胞及間充質干細胞的影響研究

彭俊，魏文娟，錢正明，黃建振，高世龍，張召才

擴張型心肌病（DCM）是一種以單側或雙側心腔擴大、心肌收縮功能減退、伴或不伴充血性心力衰竭為特征的心肌病。病毒性心肌炎是形成DCM的重要病因［1］，可引起心肌炎的病毒種類很多，其中以柯薩奇B組病毒（CVB）最為常見［2］。間充質干細胞（MSC）是一組成體干細胞，因其具有多向分化潛能、擴增迅速且低免疫原性［3］而被廣泛應用于急性心肌梗死［4-5］及慢性心力衰竭［6-7］的實驗研究中。心肌炎遠期可進展成DCM，但是MSC治療可否用于急性心肌炎患者目前尚不清楚。為此，本研究比較了病毒性心肌炎主要致病病毒——柯薩奇B3病毒（CVB3）感染對HL-1心肌細胞及MSC的影響，試圖尋找一種新的心肌炎的治療措施。

1 材料與方法

1.1 研究時間 本研究時間為2015年6月—2017年6月。

1.2 主要試劑及儀器 Claycomb培養基（SAFC Biosciences公司），DMEM培養基、RPMI 1640培養基（Invitrogen公司），胎牛血清（FBS）、MEM2×培養基（Gibco公司），腎上腺素、L-谷氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氯仿（Sigma公司），堿性成纖維細胞生長因子（Peptotech公司），SYBR green定量PCR預混液（Eurogentec公司），異丙醇（美國默克公司），1.3%純化瓊脂（Difco公司），大容量cDNA反轉錄試劑盒、7900HT快速實時PCR儀（美國應用生物系統公司），CellTiter 96?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒（Promega公司），VersaMax讀板機〔美谷分子儀器（上海）有限公司〕。

1.3 細胞培養 小鼠心肌細胞株HL-1心肌細胞保持了成年鼠心肌細胞的生物學特征，由德國U.Rauch教授贈予。Claycomb培養基含10% FBS、0.1 mmol/L腎上腺素、2 mmol/L L-谷氨酸以及1%抗生素液。所有的培養皿及培養板預先在0.1%明膠溶液中于37 ℃孵育0.5 h。人骨髓MSC（由德國M.Haag博士贈予）分離及鑒定方法見文獻［4］，DMEM培養基含10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酸、1% HEPES、2 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、1%抗生素液。HeLa細胞（購自Invitrogen公司）的培養基為RPMI 1640培養基，其含10% FBS、1%抗生素液。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測CVB3基因拷貝數HL-1心肌細胞生長至80%匯合狀態后以每孔3×105個/L接種于6孔板中，MSC生長至80%匯合狀態后以每孔2×105個/L接種于6孔板中，培養24 h后換成無血清培養基再培養1 h；分別將其分為未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組，其中感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組分別用CVB3感染4、12、24 h，未感染組僅用無血清培養基培養1 h。分別收集HL-1心肌細胞及MSC，采用Trizol法分離RNA：首先應用Trizol收集細胞，去除上清液后加入200 μl氯仿，室溫孵育15 s，4 ℃下13 200 r/m離心15 min（離心半徑11 cm），將上層透明的液體轉移至500 μl的異丙醇中，室溫孵育10 min，4 ℃下13 200 r/m離心15 min（離心半徑11 cm），用70%乙醇沖洗沉淀物，4 ℃下7 500 r/m離心15 min（離心半徑11 cm），最后將沉淀物溶于100 μl不含RNA酶的水中。應用大容量cDNA反轉錄試劑盒合成基因組DNA。總反應體積為25.0 μl，其中含上游引物及下游引物各1.0 μl、SYBR green定量PCR預混液12.5 μl、無菌去離子水 5.5 μl、基因組 DNA 或標準質粒 5.0 μl。PCR反應條件：50 ℃激活2 min，95 ℃激活10 min，進行40個循環的擴增，每個循環包括95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，最后1個循環完成后進行95 ℃ 15 s及55 ℃ 15 s的孵育。應用核糖體蛋白L32作為內參照。引物設計：鼠核糖體蛋白L32的上游引物為5'-TGCCCACGGAGGACTGACA-3'，下游引物為5'-AGGTGCTGGGAGCTGCTACA-3'；人核糖體蛋白L32的上游引物為5'-AGGAGAGACACCGTCTGAACAAG-3'，下游引物為5'-GAACCAGGATGGTCGCTTTC-3'；CVB3的上游引物為5'-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3'，下游引物為5'-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3'。反應在7900HT快速實時PCR儀中進行，用96孔PCR板，每板上設核糖體蛋白L32及CVB3標準質粒組、樣品組及陰性對照組，檢測達到設定的熒光強度時所進行的PCR反應循環數（CT值）。根據質粒標準品的檢測結果，得到拷貝數-CT值標準曲線，再根據每份標本的CT值與標準曲線的比較結果確定標本所含的CVB3基因拷貝數。實驗獨立重復3次。

1.5 MTS法檢測細胞活性 HL-1心肌細胞生長至80%匯合狀態后以每孔3×105個/L接種于6孔板中，MSC生長至80%匯合狀態后以每孔2×105個/L接種于6孔板中，培養24 h后換成無血清培養基再培養1 h；分別將其分為未感染組、感染組，其中感染組用CVB3感染，未感染組僅用無血清培養基培養1 h。分別應用CellTiter 96?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞活性。將10 000個細胞（HL-1心肌細胞及MSC）分別接種到96孔板，每孔體積100 μl。培養24 h后，將20 μl CellTiter 96?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑直接加入培養細胞，孵育2 h后，選擇490 nm波長，在VersaMax讀板機上測定各孔吸光度，即細胞活性。實驗獨立重復3次。

1.6 病毒空斑實驗檢測病毒滴度 HL-1心肌細胞生長至80%匯合狀態后以每孔3×105個/L接種于6孔板中（HL-1心肌細胞組），MSC生長至80%匯合狀態后以每孔2×105個/L接種于6孔板中（MSC組），培養24 h后換成無血清培養基再培養1 h，用CVB3感染。配備瓊脂溶液（含0.04% FBS的MEM2×培養基及1.3%純化瓊脂）備用，將CVB3感染后的HL-1心肌細胞、MSC的培養上清液分別稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6個/L備用。將HeLa細胞以每孔6×105個/L接種到6孔板，培養24 h，PBS沖洗2次后分別加入1 ml不同濃度的CVB3感染后的HL-1心肌細胞、MSC的培養上清液，37 ℃培養30 min，每孔加入2 ml瓊脂溶液，在超凈臺上放至瓊脂凝固，轉入培養箱中培養72 h，讀取瓊脂上病毒空斑數，即病毒滴度。實驗獨立重復3次。

表1 HL-1心肌細胞未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數比較（±s，n=6）Table 1 Comparisons of CVB3 genome copy number among the non-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，4-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，12-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，and 24-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group

表1 HL-1心肌細胞未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數比較（±s，n=6）Table 1 Comparisons of CVB3 genome copy number among the non-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，4-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，12-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group，and 24-hour-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group

注：CVB3=柯薩奇B3病毒

組別 CVB3基因拷貝數未感染組 0感染后4 h組 9 025±1 360感染后12 h組 25 875±1 359感染后24 h組 197 500±8 539 F值 1 563.90 P值 ＜0.01

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CVB3基因拷貝數 HL-1心肌細胞未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。MSC未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 MSC未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數比較（±s，n=6）Table 2 Comparisons of the mean CVB3 genome copy number among non-CVB3-infected MSCs group，4-hour-CVB3-infected MSCs group，12-hour-CVB3-infected MSCs group，and 24-hour-CVB3-infected MSCs group

表2 MSC未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數比較（±s，n=6）Table 2 Comparisons of the mean CVB3 genome copy number among non-CVB3-infected MSCs group，4-hour-CVB3-infected MSCs group，12-hour-CVB3-infected MSCs group，and 24-hour-CVB3-infected MSCs group

組別 CVB3基因拷貝數未感染組 0感染后4 h組 1 037±114感染后12 h組 1 110±103感染后24 h組 190±31 F值 682.08 P值 ＜0.01

2.2 細胞活性 HL-1心肌細胞感染組感染后4、12、24 h細胞活性小于HL-1心肌細胞未感染組，差異有統計學意義（P＜0.05）。HL-1心肌細胞未感染組不同時間點細胞活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；HL-1心肌細胞感染組不同時間點細胞活性比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 HL-1心肌細胞未感染組、感染組不同時間點細胞活性比較（ ±s，n=6）Table 3 Comparison of the mean cell viability between non-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group and CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group at different time points

表3 HL-1心肌細胞未感染組、感染組不同時間點細胞活性比較（ ±s，n=6）Table 3 Comparison of the mean cell viability between non-CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group and CVB3-infected HL-1 cardiomyocytes group at different time points

組別 感染后4 h 感染后12 h感染后24 h F值 P值未感染組 2.15±0.04 2.22±0.14 2.10±0.08 3.20 0.07感染組 1.73±0.08 1.40±0.05 1.25±0.06 250.39 ＜0.01 t值 10.94 16.18 27.86 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

MSC未感染組與MSC感染組感染后4、12、24 h細胞活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。MSC未感染組、感染組不同時間點細胞活性比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

表4 MSC未感染組、感染組不同時間點細胞活性比較（±s，n=6）Table 4 Comparison of the mean cell viability between non-CVB3-infected MSCs group and CVB3-infected MSCs group at different time points

表4 MSC未感染組、感染組不同時間點細胞活性比較（±s，n=6）Table 4 Comparison of the mean cell viability between non-CVB3-infected MSCs group and CVB3-infected MSCs group at different time points

組別 感染后4 h 感染后12 h感染后24 h F值 P值未感染組 1.29±0.03 1.35±0.05 1.43±0.02 21.25 ＜0.01感染組 1.49±0.11 1.29±0.05 1.36±0.04 19.73 ＜0.01 t值 0.01 0.05 0.19 P值 0.91 0.83 0.68

2.3 病毒滴度 HL-1心肌細胞組病毒滴度大于MSC組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表5）。

3 討論

MSC是一組成體干細胞，具有多向分化潛能，能自我復制且擴增迅速，同時具有低免疫原性等特點。隨著MSC相關技術的日益成熟，其越來越多地被應用于急性心肌梗死［4］及慢性心力衰竭［5］的臨床試驗中。TELUKUNTLA等［6］于急性心肌梗死患者發病10 d內通過靜脈注射MSC發現，患者心律失常發生率降低且左心室射血分數明顯改善，同時療效可持續至發病后6個月。HARE等［7］通過心外膜注射自體MSC或外源性MSC發現，急性心肌梗死患者的左心室重構及心肌瘢痕的形成均明顯改善。HAMSHERE等［8］研究發現，外周靜脈應用粒細胞集落刺激因子（G-CSF）聯合冠狀動脈內應用MSC可明顯改善DCM患者的紐約心臟病協會（NYHA）分級及運動耐量，指出利用MSC進行細胞移植或可望成為DCM心功能不全新的治療手段。而MARTIRE等［9］研究表明，MSC釋放腫瘤壞死因子（TNF）受體抑制劑，其可以通過抑制核因子-κBp65途徑的激活，改善DCM大鼠的組織重構和增加左心室射血分數。心肌炎患者遠期可進展為DCM，而MSC可否應用于病毒性心肌炎患者目前尚不清楚。為此，本研究探討病毒性心肌炎主要致病病毒——CVB3感染對HL-1心肌細胞及MSC的影響。

表5 HL-1心肌細胞組與MSC組病毒滴度比較（±s，n=6）Table 5 Comparison of the mean viral titer between CVB3-infected groups of HL-1 cardiomyocytes and MSCs

表5 HL-1心肌細胞組與MSC組病毒滴度比較（±s，n=6）Table 5 Comparison of the mean viral titer between CVB3-infected groups of HL-1 cardiomyocytes and MSCs

注：MSC=間充質干細胞

組別 病毒滴度（pfu./ml）HL-1心肌細胞組 161±6 000 MSC組 0 t值 123.048 P值 ＜0.01

CVB3是單股正鏈RNA病毒，具有mRNA活性和感染性。其生命周期是利用宿主細胞內的代謝工具來完成自身的拷貝及病毒組裝，首先，病毒衣殼蛋白與宿主細胞表面特定受體之間發生特異性結合，然后，通過受體介導的胞飲作用進入細胞，緊接著，病毒在細胞內完成復制及病毒蛋白的合成，最終，通過細胞裂解而釋放出來進入下一個生命周期［10］。已有研究表明，MSC能夠降低CVB3感染小鼠的心肌細胞凋亡率及壞死率，抑制TNF的表達和單核細胞的激活，從而改善心肌收縮、舒張功能［11］。而且，與成纖維細胞相比，MSC可通過降低CVB3感染的野生型大鼠TNF-α、白介素1β和白介素6等，改善大鼠左心功能異常情況［12］。本研究結果顯示，HL-1心肌細胞未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數有差異，MSC未感染組、感染后4 h組、感染后12 h組、感染后24 h組CVB3基因拷貝數有差異；HL-1心肌細胞感染組感染后4、12、24 h細胞活性小于HL-1心肌細胞未感染組，HL-1心肌細胞未感染組不同時間點細胞活性無差異，HL-1心肌細胞感染組不同時間點細胞活性有差異；MSC未感染組與MSC感染組感染后4、12、24 h細胞活性無差異，MSC未感染組、感染組不同時間點細胞活性有差異；HL-1心肌細胞組病毒滴度大于MSC組；說明CVB3能夠在HL-1心肌細胞中復制，但不能在MSC中復制，這可能與MSC中缺乏柯薩奇腺病毒受體（CAR）的表達［13］、細胞外信號調節激酶1和2（ERK1/2）和蛋白激酶B（PKB）的激活［14］、泛素蛋白酶體系統（UPS）有關［15］。

本研究組設想，以后可通過CVB3不能在MSC中復制的特點，利用MSC自身的免疫調節作用及旁分泌效應［16］，將HL-1心肌細胞與MSC共同培養，觀察CVB3感染后的HL-1心肌細胞的病毒復制、細胞活性及細胞培養上清液中病毒滴度，試圖尋找新的心肌炎的治療措施。本研究不足之處在于僅完成了基礎實驗部分，如果同時結合動物實驗可能更具有說服力。

綜上所述，CVB3能夠在HL-1心肌細胞中復制，感染CVB3后HL-1心肌細胞活性降低；但CVB3不能在MSC中復制，且感染CVB3后MSC細胞活性并未明顯改變。提示可以根據MSC的這個特點將其進一步應用于急性心肌炎的治療中。

作者貢獻：彭俊負責本研究實施以及論文撰寫，并對文章整體負責；魏文娟、錢正明、黃建振、高世龍參與資料的收集與整理；張召才負責本研究的構思與設計，論文的修改，并進行審校與質量控制。

本文無利益沖突。