洋蔥花青苷合成相關基因表達與不同層鱗片顏色的關系

陳微 惠林沖 李威亞 潘美紅 郇國磊 何林玉 繆美華 楊海峰

摘要：為了探討洋蔥不同層肉質鱗片花青苷含量的區別，以及花青苷合成相關基因與含量之間的關系，采用高效液相色譜（HPLC）和實時熒光定量PCR技術，分析了不同層鱗片花青苷含量，以及與花青苷合成相關基因的差異表達情況。結果顯示，花青苷含量與洋蔥鱗片顏色深淺呈正相關，洋蔥鱗片顏色越深，花青苷含量就越高。第2層花青苷含量最高，第4層和第6層含量差異不明顯。在第2層鱗片中，苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）、查耳酮合成酶基因（CHS）和查耳酮異構酶基因（CHI）的相對表達量較高，與花青苷的含量表現一致。黃烷酮-3-羥化酶基因（F3H）、二氫黃酮醇還原酶基因（DFR）、花青素合成酶基因（ANS）和類黃酮-3-O-糖基轉移酶基因（UFGT）的表達量在第6層鱗片中較高，這與后期洋蔥內部鱗片顏色逐漸加深相一致。

關鍵詞：洋蔥;鱗片;花青苷;相關基因;基因表達

中圖分類號：S633.201 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0054-04

收稿日期：2021-05-17

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（20）3164];連云港市財政專項（編號：QNJJ1904）。

作者簡介：陳 微（1990—），女，山東菏澤人，碩士，助理研究員，主要從事蔬菜育種和栽培研究。E-mail：1135050599@qq.com。

通信作者：楊海峰，副研究員，主要從事蔬菜育種和栽培研究。E-mail：13775492959@163.com。

花青素，廣泛存在植物的葉、花、果實等器官中，賦予植物橙、紅、紫、藍等色彩 [1]，保護植物免受各種生物和非生物的脅迫[2-3]。花青素作為重要的黃酮類化合物，不僅具有豐富的色彩，還對人體的健康起到有益的作用。攝入花青素還可以有效改善血糖平衡，預防心臟病、改善視力。富含花青素的食品由于其誘人的顏色和對人體健康的有益作用而變得越來越受歡迎。存在于植物中的花青素主要有飛燕草素、天竺葵素、矢車菊素、芍藥素、矮牽牛素和錦葵色素6種。花青素在植物體內不穩定，主要以花青苷的形式存在。花青苷的生物合成受結構基因和調節基因的共同調控[4-5]。其合成途徑的關鍵基因主要包括苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）、查耳酮合成酶基因（CHS）、查耳酮異構酶基因（CHI）、黃烷酮-3-羥化酶基因（F3H）、二氫黃酮醇還原酶基因（DFR）、花青素合成酶基因（ANS）、類黃酮-3-O-糖基轉移酶基因（UFGT）[6-7]。

洋蔥是世界范圍內種植的重要蔬菜作物之一，鱗莖顏色是洋蔥重要的表型特征，常見的有紫、紅、粉紅、黃、淡黃、白等。類黃酮類化合物，如花青苷，主要參與鱗莖顏色的形成，花青苷成分及含量的差異直接影響植物各器官顏色的呈現，在洋蔥鱗莖中發現至少50種不同的黃酮醇和花青苷[8]。洋蔥是膳食類黃酮最豐富的來源之一，在植物和人類營養與健康中起著重要作用。近年來，消費者對富含花青苷的洋蔥品種，特別是對花青苷含量較高的紫皮洋蔥品種的需求日益增加。因此研究洋蔥花青苷分布及成分含量具有重要意義。

紫皮洋蔥由外到內顏色逐漸變淡，其中不同層鱗片花青苷的含量及相關基因的表達尚未有報道，鑒于此，本研究采用高效液相色譜（ HPLC） 和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法，檢測洋蔥不同層鱗片的花青苷含量，探討花青苷生物合成相關基因的表達與含量的關系，以期為培育富含花青苷洋蔥品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 洋蔥材料

本研究所采用的洋蔥品種為連蔥11號，2019年9月于連云港市農業科學院東辛試驗基地播種，5月下旬收獲，1個月后取樣，由外到內依次選取肉質鱗片的第2層、第4層和第6層。每層取3個重復樣品。樣品盡量選取紫色的部分，迅速置于液氮中，于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 花青苷的檢測

準確稱取約1 g植物樣品，于液氮中研磨至粉末;加入10 mL提取液，4 ℃水浴超聲提取0.5 h;以10 000 r/min于4 ℃離心5 min，取上清，沉淀再提取1次，合并上清液;加入5 mL濃HCl，90 ℃水浴40 min;過0.22 μm 濾膜，進行高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）檢測。

1.3 總RNA的合成和cDNA的合成

采用天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒提取洋蔥總RNA。以提取的植株總RNA為模板進行反轉錄，獲得cDNA，所用的反轉錄試劑是vazyme Hiscript Ⅱ Q RT Super Mix for qPCR （+gDNA Wiper）（Vazyme，中國南京）。操作方法參照試劑盒說明書進行。

1.4 熒光定量

通過熒光定量PCR檢測花青苷合成相關基因在不同層鱗片中的差異表達，使用Beacon Designer設計基因的特異性引物，以Actin-F 和Actin-R 作為內參。反應體系為10 μL，每個植株樣品3次技術重復。兩步法熒光定量PCR 擴增條件的設置：（1）擴增曲線：95 ℃ 5 min，循環1 次;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環40 次，72 ℃單點檢測信號;（2）熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，連續檢測信號。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。用于 RT-qPCR 分析的定量引物見表1。

2 結果與分析

2.1 洋蔥不同層花青苷的含量

每層鱗片3次重復，去除差異較大的一個，每組留2個數據。洋蔥鱗片由內而外，紫色逐漸變淺，花青苷的含量也逐漸減少。說明花青苷含量與洋蔥鱗片顏色深淺呈正相關，洋蔥鱗片顏色越深，花青苷含量就越高。第2層花青苷含量最高，平均含量達到1 150.186 μg/g，明顯高于第4層和第6層，但第4層和第6層花青苷的含量差異不太明顯（圖1）。

2.2 花青苷合成相關基因的變化

通過熒光定量PCR對不同層花青苷合成相關的基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT1和MYB1轉錄因子的表達量進行了分析，材料選用第2層和第6層鱗片。以第2層相關基因的表達量作為對照，結果（圖2）顯示，基因的表達水平與花青苷的含量呈現一定的相關性。第2層鱗片中，基因CHI、CHS、PAL和MYB1的表達量比第6層鱗片中相關基因的表達量高，尤其是MYB1和CHI這2個基因的表達量明顯高于第6層。但F3H、ANS、DFR和UFGT1的相對表達量低于第6層。

3 討論與結論

洋蔥以鱗莖為主要食用器官，富含鉀、維生素C、鋅等營養元素。鱗莖顏色是洋蔥的重要特征，是在日長響應后用于區分洋蔥品種的重要標準。目前，洋蔥中存在多種鱗莖顏色，例如白色、黃色、紅色、粉紅色、淡黃色和金色。在對鱗莖顏色的研究中發現黃酮類化合物是洋蔥鱗莖色素沉著的原因。花青素賦予植物豐富的色彩，是植物中發現最重要的黃酮類之一[9]。紫皮洋蔥中因含有豐富的花青苷，越來越受到消費者的喜愛。

洋蔥中花青苷的含量主要集中在每一層的表皮中，白色的肉質鱗片中幾乎不含花青苷，但洋蔥表皮和肉質鱗片緊密結合，每一層的肉質鱗片厚度不一，因此，測定每一層花青苷的含量時可能存在一定的差異，本研究所選取的樣品為表皮和靠近洋蔥表皮的部位，因此，結果相較于Zhang 等測定的花青苷的含量[10]總體較高。另外，還有一種可能是因為，此次種植的洋蔥后期處于干旱狀態，導致花青苷的含量上升，這與他人的研究結果[11-14]相似，花青素在干旱、高溫、強光或強紫外線照射等不利的環境條件下，含量可能會上升。但此次測定的花青苷含量與肖瑞希等測定的花青苷含量[15]接近。

本試驗中第4層和第6層花青苷的含量較高，但差異不顯著，這與此次選用的品種有關，一般紫皮的品種，花青苷含量主要集中在第2層，而連蔥11號從外到內紫色都較深，且貯藏的時間越長，內部顏色越深。

花青苷早期合成基因CHS、CHI和F3H等是常見的類黃酮途徑基因，參與所有下游類黃酮的生物合成。通常，報道的早期花青苷合成基因的表達特征各不相同，茄類蔬菜中早期花青苷合成基因的表達水平與花青苷含量之間沒有一致的相關性。花青苷晚期合成基因DFR、ANS和UFGT等是特定種類的類黃酮（包括花青素）的生物合成所必需的。在許多蔬菜中一直觀察到晚期花青苷合成基因表達水平與花色苷含量之間呈正相關[16]。

查耳酮異構酶催化查耳酮生成二氫黃酮醇，其基因的表達水平間接影響花青苷的合成。CHI功能的喪失可能導致金色鱗莖的產生，這可能是由于查耳酮的積累所致[17]。在Schwinn等的研究中，MYB1被認為是花色苷生物合成的正調節劑，通過短暫過度表達MYB基因可誘導洋蔥組織中花青素的產生，通過RNAi瞬時抑制該基因，色素沉著減少[18]。PAL是花青苷合成途徑的一個關鍵酶，梁毅等通過Real-time PCR發現AcPAL1基因在紅皮、黃皮、白皮洋蔥中表達量依次減少，隨著鱗莖膨大，其表達量卻不斷降低[19]。在本研究中，第2層鱗片中花青苷早期合成基因CHI、CHS、PAL的表達水平高于第6層，與花青苷的含量呈正相關。

DFR-A基因的序列分析結果表明，該基因的失活導致花色苷合成的阻滯，從而導致黃色色素積累[20]。Zhang等的研究同樣表明，DFR基因在深紅色鱗莖的生物合成中起關鍵作用[21]。張洪偉等在洋蔥中克隆了UFGT1和UFGT2基因，發現這2 個基因均在紅皮洋蔥鱗莖中大量表達，在黃皮和白皮洋蔥中幾乎不表達[22]。在含花青素色素的辣椒果實發育過程中，CaF3′5′H、CaDFR、CaANS和CaUFGT在幼果期上調表達，在成熟前達到最大值，然后在成熟后下調表達，對應于花色苷瞬時積累模式[23-25]，本研究結果與之相似，第6層鱗片中F3H、ANS、DFR和UFGT1的表達水平高于第2層，其原因可能是由于在洋蔥的貯藏過程中，內部鱗片逐漸變紅，花青苷含量增加，所以花青苷后期合成基因的表達水平上升，但具體的原因有待于探討。目前，關于洋蔥鱗莖的呈色機制以及外部環境對花青苷積累的影響還有待進一步研究，這將為從分子方面選育富含花青苷的洋蔥品種打下基礎。

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