對標準《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》的幾點思考

孫曉東 呂全 趙曉濤 許時燕 林祖銳 周耀武 段凱霞 丁春麗 陳柒言 田鵬

血涂片鏡檢法檢出瘧原蟲是確診瘧疾的最直接證據，該法具有成本效益高和可鑒別蟲種等優點[1]，是瘧疾病原學診斷最常用的方法之一，也是我國消除瘧疾行動計劃（2010-2020年）瘧疾診斷首選方法[2]。世界衛生組織（WHO）建議已消除或正在消除瘧疾的國家應維持有質量保證的瘧疾診斷能力[3]，《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》（WS/T 569—2017）行業標準的頒布與實施，為我國消除瘧疾血涂片鏡檢提供了統一的操作流程和技術規范[4]，保障了顯微鏡鏡檢質量。雖然學者王善青對標準進行了詳盡的解讀[4]，但通過比對WHO推薦方法[5-6]和云南現場實際應用，幾個核心問題值得商榷。

1 血涂片的制作

1.1 取血方法

我國標準規定用“已消毒推片”從刺血部位刮取血樣再涂制于載玻片，而WHO推薦方法是用載玻片從刺血部位蘸取血樣再用推片涂制。兩種方法的流程剛好相反，但根據我國《醫療機構消毒技術規范》（WS/T 367—2012），上述取血的推片和載玻片都因接觸破損皮膚均屬高度危險性物品，兩者都應進行高水平消毒或滅菌處理[7]。我國標準明確規定用“已消毒推片”，而WHO推薦方法對載玻片的準備只是清潔和分包保存，未“消毒”處理，這顯得我國標準略為嚴謹。問題是在我國消除瘧疾行動計劃中，開展血涂片鏡檢的項目活動有兩項，一項是被動病例偵查，即病例到醫療機構就診由化驗室（實驗室）開展的鏡檢，尤其是瘧疾流行區的哨點醫院承擔著門診發熱病例數1%～10%的監測任務[8]，僅云南一年的血檢總數不少于30萬人次；另一項是主動病例偵查，即疾控機構到現場進行人群篩查（調查）開展的鏡檢，尤其是本地感染病例疫點處置中的主動病例偵查需對疫點全民進行血檢篩查。這兩項活動如果根據我國標準則需準備足夠的甚至成百上千數的“已消毒推片”。雖然我國標準未對“推片”進行詳細的規定，但使用“邊緣光滑的載玻片”[9]作為推片是每次瘧原蟲鏡檢培訓的內容之一，云南也多次省級采購邊緣拋光的雙凹載玻片作為專用推片分發全省，其采購價遠高于普通載玻片，無法像刺血針一樣成為一次性用品，這就要求推片必須重復使用。在現場工作中，為防止肝炎、艾滋病等血液傳染病的傳播，已使用過的被血液污染的推片經酒精簡單消毒再刮取下一位病例血液是嚴格禁止的，如果按照我國標準，這些推片則需進行嚴格的清洗清潔和高水平消毒滅菌，這是費時費力又復雜繁瑣的一個工作。WHO規定用“邊緣拋光的載玻片”作為推片涂制科學研究中的血涂片[6]，而在臨床診斷中推片屬可選設備[5，10]，一般用另一張載玻片的一角和短邊側緣涂制血膜，雖然涂制的薄血膜舌型邊緣可能會有“毛刺”，但其載面未受到血液污染，這張載玻片又可蘸取下一病例的血樣。因此，WHO推薦的取血方法雖“未消毒”可能存在一定風險，但基本避免了血液污染物接觸破損皮膚，也免除了“已消毒推片”的投入和制備步驟。

我國標準規定“用拇指和食指夾持推片側緣中部，用推片左下角刮取血液4～5 μl用于制作厚血膜，再用該端中部刮取血液1～1.5 μl用于制作薄血膜”。根據上述，推片即是邊緣光滑（拋光）的載玻片，而載玻片大小一般為76 mm×26 mm長方形玻璃片，我國標準即是用拇指和食指捏住推片的長邊（76 mm）中部，用左側短邊（26 mm）下角先刮取厚血膜血樣，再用左側短邊的中部刮取薄血膜血樣。雖然用推片一次性刮取厚薄血膜血樣在涂制時可在載玻片上精確確定血膜的位置，方便厚薄血膜在載玻片上的整體布局，但可能出現以下問題：一是將推片左下角的血樣涂于載玻片制作厚血膜時，由于血樣在推片左下角過于朝上或偏向薄血膜血樣，推片不得不盡可能平倒或平放以便血樣能涂于載玻片，因厚薄血膜血樣在推片左側短邊的同一面且間距極小（≤13 mm），這樣也可能誤把薄血膜血樣沾于載玻片的錯誤位置。二是我國標準規定厚血膜涂制完成后“用干棉球抹凈推片左下角上的血漬”，因薄血膜血樣距左下角極近（≤13 mm），擦拭左下角極有可能把薄血膜血樣也擦掉。三是用推片刮取血樣，有可能把酒精消毒時未擦凈的油漬或皮屑等刮下來而影響血膜質量。四是我國標準明確規定了厚薄血膜的血量，但缺乏生動形象的參照，刮取時只能通過擠壓刺血部位控制出血量大概的估算刮取的血量和刮取次數，需要一定的經驗積累，刮取后至血膜涂制前，無任何調整或修正的余地。WHO推薦方法是在載玻片的中央先蘸取一小滴血用于制作薄血膜，在離薄血膜血滴1 cm處蘸取2～3大滴血用于制作厚血膜，其用直徑大概3 mm的小紅點圖示薄血膜血量，可通過擠壓刺血部位控制出血量來確定蘸取血量和次數，在蘸取過程中，也可透過載玻片來觀察蘸取血樣情況決定蘸取的輕重，蘸取血樣后，尚可用推片的一角快速調整或修正厚薄血膜的血量（如薄血膜血量過少或過多，可從厚血膜血滴中余出或余進）。WHO推薦針刺后的第一滴血應擦除，這樣可通過第一滴血的出血情況預判第二滴出血量和擠壓力度，但擠出的第二滴血處于圓整狀態，蘸取的薄血膜血量往往過多。也因其先蘸取薄血膜血滴，在制作薄血膜時中間隔了厚血膜取血過程，如果涂片者行動稍慢和天氣干熱，薄血膜血滴容易干燥而影響薄血膜質量。同時，厚薄血膜之間的預留的位置過寬，雖然可通過引導厚血膜的圓心方向來調整厚薄血膜之間的距離，但其2～3滴布局導致其引導力度有限。因此，WHO推薦方法對厚薄血膜在載玻片上的整體布局稍顯隨意，但其對厚薄血膜血量的可控性好，涂制過程中不需擦拭清潔推片。

1.2 血膜制作

我國標準未對厚薄血膜的制作進行詳細的規定，僅是“由里向外劃圈涂成直徑0.8～1.0 cm的圓形厚血膜”和“使2張玻片保持25°～35°，從右向左迅速向前推成舌狀薄血膜”簡單的結果性描述。因我國標準規定用推片的短邊同時刮取厚薄血膜血樣，這樣厚薄血膜制作順序只能是先厚再薄，也只能用推片的短邊來制作薄血膜（本文用推片的短邊制作薄血膜的手法稱為豎推法，用推片的長邊來制作薄血膜的手法則稱為橫推法）。WHO推薦方法是把蘸取血樣的載玻片放在一個穩固平臺上來涂制厚薄血膜，順序是先薄再厚，手法也只能是豎推法。然而在平臺上制作血膜，雖然能更好的使血樣在推片與載玻片接觸面水平擴散和保持厚血膜厚度均勻，但平臺的高矮和水平程度將影響血膜制作，特別是基層現場工作，涂制血膜的平臺將是必備品。而且在平臺上涂制薄血膜時，捏持推片的手臂因為重力無形中產生一種向下的力量，制出薄血膜往往太薄，也無法保持推片前推的方向，對于血液過于黏稠而不沿接觸面擴散的處置能力差。同時，WHO推薦把推片的短邊壓在薄血膜血滴之上，等血液沿接觸面擴散后再前推，這樣壓在血滴上面，推片后面的血有時候未完全擴散會留下一部分形成一個小血斑，即減少了制作薄血膜的血量，涂制血膜有時會存在“拖尾”現象。臨床血液一般檢驗是血液學檢驗最基礎的一類檢驗項目，血涂片制備是檢驗人員必備技能之一，而薄血膜的厚薄長短與血滴的大小、推片的角度、推片速度及血細胞比容有關，一般認為血滴大、角度大、速度快則血膜越厚，反之越薄[11]。在云南實際工作中，豎推法和橫推法兩種推片手法均同時存在，這取決于個人習慣和受訓情況，其中中老年人群多用橫推法，青年人群多用豎推法，但兩種推片手法孰優孰劣未見相關報道。

1.3 厚血膜厚度

我國標準規定厚血膜厚度“以1個油鏡視野內可見到5～10個白細胞為宜”，而WHO推薦是平均每個油鏡視野10～15個白細胞為佳[6]。尚不說兩種方法確定的白細胞數有差異，關鍵是這兩種方法都是染色后鏡檢的結果指標，對血膜制作過程中的厚血膜厚度的參考意義不大。我國和WHO曾用“透過血膜能剛好看見印刷的字跡”[10，12]作為厚血膜厚度的制作指標，方便涂片者掌控血膜厚度和大小。

1.4 現場應用

根據上述比對，理想的血涂片制作方法及步驟是：針刺取血部位后，右手手心朝下、拇指和食指捏住載玻片長邊側緣后1/3（手指勿碰載物面，如載玻片單側磨砂，則磨砂端朝左和磨砂面朝下），在朝下的載物面中央偏左蘸取一個火柴頭大小的血滴用于制作厚血膜，在中央偏右蘸取1/4火柴頭大小血滴用于制作薄血膜，厚薄血膜血滴間距1 cm左右。翻轉右手心朝上，用左手拇指和食指從右手下方捏住載玻片的短邊側緣（薄血膜血滴朝左手拇指），并保持載玻片水平。用右手拇指和食指捏住推片長邊側緣前端（距前角5 mm左右），將推片短邊下緣平抵載玻片薄血膜血滴前5 mm（勿壓在血滴上），拇指和食指捏住推片的同時輕抵載玻片長邊側緣形成滑槽（橫推法僅是用握住推片的食指指背輕抵，其他相同），保持推片與載玻片25°～35°，推片先緩慢后退刮取全部血滴，觀察血樣沿推片與載玻片接觸面擴散，距長邊側緣1～2 mm時推片后退變前推，快速從右至左直抵左手拇指，前推時，只有前推的力量，無下壓的力量，中間勿停頓或抬起直抵左手拇指。用推片的下角向左或向右由里向外劃圈涂成透過血膜能剛好看清印刷字體、直徑0.8～1.0 cm的圓形厚血膜，厚薄血膜間距5～8 mm左右。事實上，這是云南目前普遍采用的方法和步驟（少部分用推片刮取血樣），這即結合了我國標準與WHO推薦方法的優點，又克服了兩種方法的不足，如用載玻片蘸取血樣減免了“已消毒推片”的投入與制備，工作中只需準備3～5片專用推片，涂制后用酒精棉球擦拭干凈晾干即可等等，該方法從取血樣到涂制血涂片，中間無需擺放和清潔，特別是左手持載玻片右手持推片，姿勢更協調，豎推法和橫推法都可實現。

2 薄血膜固定

我國標準規定“用棉簽蘸取甲醇溶液，均勻輕抹于薄血膜表面”的固定方法。由于薄血膜極薄和甲醇易揮發干燥，因商用的醫用棉簽的棉花是裹緊的，棉簽與載玻片接觸面積較小和吸取溶液量少，如果“輕抹”是輕點/輕按，用棉簽固定則易產生遺漏，染出的薄血膜就有漏洞，如果“輕抹”是輕擦抹，則易損壞薄血膜，固定后的棉簽上可見血樣殘留，油鏡鏡檢薄血膜可能會有淡淡的薄霧感。WHO推薦方法是用甲醇浸濕的棉球輕點或把薄血膜浸入甲醇溶液的固定方法。棉球蓬松吸水性好，操作容易但會造成甲醇浪費，另一方法用無色廣口瓶盛裝甲醇溶液，厚血膜朝上的把薄血膜侵沒于溶液中進行固定。此法如果甲醇溶液過少，需整張載玻片伸入廣口瓶內才能侵沒薄血膜，則瓶內高濃度的甲醇蒸汽可能會把厚血膜也固定，因此廣口瓶的甲醇溶液需保持一定容量。在云南實際工作中，固定薄血膜最常用的方法用滴管吸取甲醇后，保持薄血膜和滴嘴均朝下的貼在一起，滴嘴略超出載玻片少許，輕捏吸頭的同時滴管向下劃過薄血膜進行固定，也有的保持載玻片厚血膜朝上的一定傾斜，把甲醇滴在薄血膜起始端，用滴管攤開或直接用甲醇溶液覆蓋薄血膜進行固定，極少人用自制的蓬松加長棉簽或用2～3根醫用棉簽蘸取甲醇染液后輕拖抹或輕點薄血膜固定。

3 吉氏染色

我國標準規定用3%和10%工作液染色臨床檢測的單張血片，用2%工作液染色現場調查的成批血片，雖然詳細規定了3種濃度的配比，但配制前均需計算各液體的容積，尤其是染色單張或少量血片工作液的配制，定量移液器成為必備品。WHO推薦10%快染和3%慢染兩種染色方式，其中10%快染用于急需結果的1～15張血片染色，其工作液配制是1 ml緩沖液加3滴染液原液，3%慢染是用3%工作液對20及以上調查研究及教學血片進行染色。我國標準的單張血片染色和WHO推薦的快染用途和染色方法一致，都是把血片水平擺在染色盤的橫架上，都是吸取3 ml新配制的工作液覆蓋血膜，但WHO工作液配制方法更為簡便易行。問題是3 ml工作液是全覆蓋載玻片，即浪費染液又極易導致外溢，尤其是拿起已染好血片沖洗時極易引起染液外溢而影響染色質量。我國標準的2%批量染色和WHO推薦的3%慢染用途和方法也一致，都是用染色缸（架）大批量染色，但此法消耗染液量極大，例如用10槽玻璃染缸背靠背的染色20張血片，需配制100 ml工作液使用染液原液2～3 ml。我國和WHO均詳細規定了緩沖液的配制，但WHO推薦了一種簡便方法，即用商品化“緩沖片”加入一定量的水，這有利于條件有限的基層機構維持染色質量。在云南實際工作中，一部分使用商品化的吉氏染液原液和配套緩沖液，一部分使用省級配發的雙重過濾吉氏染液原液，用pH為7左右的瓶裝水替代緩沖液。染色方法是1 ml水加3滴染液原液染色8～10分鐘的快速染色和1 ml水加1滴染液原液染色30～45分鐘的標準染色，工作液配制量是（N+1）ml（N為血片數），用吸管吸取新配制的工作液2 ml，從血膜上3～5 cm高度滴下，利用工作液自由落體覆蓋全血膜，這樣既節省昂貴的染液，又方便基層掌握操作。

4 結語

云南歷史上屬我國高瘧區，發病率常年位居全國榜首，在云南抗擊瘧疾近70年的歷程中，云南瘧防工作者積累了豐富的符合云南實際的工作經驗，本文僅從云南工作實際出發，因未掌握其他省份或其他更為先進的瘧原蟲顯微鏡檢測技術，尚不能形成建議或意見，僅供學者商榷。