肺癌患者化療前后血漿let-7a表達水平與化療藥物療效相關性分析

彭微 劉潔 袁桂

412000湖南中醫藥高等專科學校基礎醫學部，湖南株洲

因肺癌早期癥狀不明顯，常常被患者忽略。近年來肺癌在我國發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。目前，由于肺癌早期診斷率低，多數肺癌患者發現時已喪失手術機會，化療成為肺癌晚期患者最主要治療手段。因此肺癌晚期患者生存率及預后取決于對其化療藥物的敏感性。因此，提高晚期肺癌患者化療療效是目前臨床關注的重點問題。MicroRNA是近年發現的一類單鏈小分子RNA，對其的研究已成為一個新的熱點。最近的研究發現，1et-7a 在細胞內影響著基因的表達調控，在疾病發生中具有重要的作用，尤其是在腫瘤的發展過程中，let-7a扮演著不可替代的角色。目前有大量研究顯示，miRNAs和腫瘤的發生發展有密切關系，提示其可能是一種新型腫瘤標記物。因此深入研究miRNAs和肺癌發病機制的關系，有可能為肺癌的診治提供新靶點[1]。let-7a 是第一個被報道與肺癌相關的miRNA，近年來越來越多研究表明，let-7a的表達水平在腫瘤細胞對化療敏感性中起一定調節作用。Let-7a在腫瘤細胞與正常細胞中存在明顯差異，因此let-7a 在腫瘤早期診斷方面可能有重要意義。研究證實，let-7a參與細胞分化、增殖和凋亡、個體發育、機體代謝以及病毒感染等過程，并且在多種腫瘤中扮演重要的角色。Let-7a 的表達水平在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中顯著下調，而且肺癌和乳腺癌中let-7a 的表達水平與患者的生存時間呈正相關。因此，本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測肺癌晚期患者化療前后let-7a 水平變化，并觀察其與順鉑聯合5-Fu/CF 化療方案療效的關系，為逆轉化療藥物耐藥提供新的治療靶點，為指導臨床化療用藥提供理論依據。

資料與方法

選取晚期肺癌患者60例，所有患者術前均未接受過放化療及細胞分子靶向等任何治療，所有患者均簽署知情同意書。

方法：入院后1次/2周重復順鉑聯合5-Fu/CF 化療方案治療，6 個化療周期后進行療效評估。并采集60例患者化療前后外周血。①血漿標本采集：抽取化療前患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，6 個化療周期后再抽取1次，血漿加入EDTA抗凝劑，常溫下4 h內處理。4℃下1 200 r/min 離心10 min，血漿和血細胞分別用1.5 mL 無RNase 的離心管分裝，-80℃冰箱保存備用。②血漿總RNA 提取：將400 μL 血標本 血漿移至1.5 mL 的EP 管中，4℃，1 200 r/min，離心10 min。離心后收集血漿至另一新的EP管中。加入Trizol試劑，Trizol試劑∶血漿比例為1∶0.8。混合均勻，繼續離心處理。取上層清液。測定RNA 濃度和純度。③血漿let-7a檢測：按照上海吉瑪制藥技術有限公司 Hairpin-itTM miRNAs qPCR QuantitationKit 試劑盒說明進行qRT-PCR操作。按照通用反轉錄條件進行轉錄，95℃30 s，95℃10 s，55℃15 s，72℃20 s，循環40次，每個樣本重復3次。另外擴增β-actin作為內參基因。

療效評價標準：療效評定參照《實體瘤療效評定標準》進行[2]，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)、疾病進展(PD)。總有效率(RR)=(CR+PR)/總例數×100%。4 周后，CR 或PR 者行CT復查進行療效確認。

統計學處理：數據應用SPSS 15.0 軟件處理；計量資料以(±s)表示，采用t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

患者化療前后血漿let-7a 表達情況比較：60例患者化療后血漿let-7a 表達水平為(2.09±0.37)，顯著低于化療前水平(4.29±0.45)，差異有統計學意義(P=0.019 6，P＜0.05)。

let-7a的表達與化療藥物療效相關性分析：順鉑聯合5-Fu/CF 化療方案治療后，對60例肺癌晚期患者進行療效評估，結果顯示，化療前血漿let-7a 在(CR+PR)組的表達量為(2.60±0.47)，明顯低于(PD+SD)組的(4.92±0.50)，差異有統計學意義(P=0.021 3，P＜0.05)。由此證明，血漿let-7a 的表達有可能與化療藥物療效存在相關性。抑制let-7a 的表達可以增加患者對化療藥物的敏感性。而let-7a高表達也可提示對鉑類藥物化療的抵抗。

討 論

肺癌患者早期主要表現為咳嗽、咳血、胸痛、胸悶氣短、貧血等癥狀，病情易被掩蓋或忽略。肺癌患者發現往往病情已進展至晚期，具有較高死亡率。對于此類患者，臨床通常多采用化療方法治療。然而多數化療藥物在殺傷腫瘤細胞時，化療藥物細胞毒作用的無選擇性和對宿主全身不良反應限制了療效的提高，從而使化療不能順利進行[3]。因此，如何提高腫瘤對化療藥物的敏感性，增加化療藥物療效，已成為臨床關注重點，同時也是提高肺癌晚期患者生存率的關鍵。

Let-7a 作為一種抑癌基因在肺癌、乳腺癌、前列腺癌中表達顯著下調。Let-7a靶向抑制c-Myc，使c-Myc所激活的細胞增殖信號通路失活。K-Ras 是信號通路EGFR/RAS/MAPK 中的關鍵分子，對腫瘤細胞增殖、遷移中發揮重要作用。

Let-7a 可以通過下調k-RAS 及HMGA2 基因的表達，抑制肺癌細胞的侵襲及增殖。研究證實Let-7 低表達的肺癌患者復發時間短，預后不良。將Let-7a 構建到A549 肺癌細胞株中，通過皮下種植、尾靜脈注射接種小鼠體內，結果發現let-7a 能抑制肺癌的生長及轉移。

Sorrentino 等[4]研究表明let-7 家族的異常表達可以影響腫瘤對紫杉醇、阿霉素等化療藥物的敏感性。Chang 等[5]研究顯示let-7g 表達水平與使用順鉑聯合5-FU 或希羅達(CF)的晚期胃癌患者從治療到進展時間(TTP)呈正相關。Yang等[6]發現在接受含鉑類化療方案的患者中，化療耐藥患者腫瘤組織中的let-7i 表達顯著下降，進一步的體外實驗證實let-7i與卵巢癌細胞對順鉑的耐藥相關。Liu等[7]研究發現let-7i 的低表達與接受奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-FU(FOLFOX4)新輔助化療的不良病理緩解及預后相關。魏彥玲等[8]發現let-7f 在胃癌阿霉素耐藥細胞株SGC7901/ADR 中的表達顯著降低，逆轉let-7f 表達可增加其對阿霉素耐藥性。

順鉑是肺癌治療中非常經典的化療藥物，已被廣泛用于治療肺癌。目前臨床主要采用順鉑聯合5-Fu/CF 化療方案。國內外臨床研究顯示，順鉑聯合5-Fu/CF化療方案復發率較低，能夠顯著提高患者生存率，具有較好臨床效果[9]。本研究以我院收治肺癌晚期患者60例為研究對象，檢測其化療前、后血漿let-7a的表達變化，分析let-7a 水平與化療藥物療效的相關性。結果顯示，肺癌晚期患者化療后let-7a 水平明顯低于化療前，差異有統計學意義(P＜0.05)。說明順鉑聯合5-Fu/CF 化療方案能夠影響let-7a 的表達水平，提示順鉑聯合5-Fu/CF 化療方案可能通過降低血漿中let-7a的表達來抑制腫瘤的發展。與此同時，(CR+PR)患者血漿中let-7a 表達低于(SD+PD)，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示血漿let-7a 的表達可能與化療藥物的療效存在相關性。說明，血漿let-7a 有可能成為預測化療藥物療效的潛在性生物指標。