超支化淀粉-抗壞血酸包合物的制備及其光熱穩定性

顧子玄，金征宇，孫冰華，田耀旗

(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

淀粉可以作為天然壁材包埋緩釋功能活性物質[1]，且其具有良好的生物兼容性。淀粉基壁材制備常見的手段有化學、物理、酶法[2]或聯合改性的方法[3]。目前淀粉化學改性已有報道如交聯淀粉[4]和OSA淀粉[5]，但其存在交聯劑安全性、取代基分布不均勻等問題；物理改性方法局限于溫濕度、壓力等物理場的控制；而酶法改性以其種類多、來源廣、多酶聯合可以獲得不同效果等具有顯著優勢[6]。

抗壞血酸(ascorbicacid,AA)，作為抗氧化劑在食藥、輕化領域有著廣泛的應用，但其活躍的二烯醇結構使其在空氣和溶液中極易被氧化[7]生成脫氫抗壞血酸以及2,3-二酮古樂糖酸而失去功能活性。目前國內外對保護其穩定性做了諸多研究。如化學改性抗壞血酸使其變成鈉鹽鈣鹽或酯化成鹽[8-9]，這些方法雖然保護了其穩定性但破壞了自身理化性質。近年興起的微膠囊包埋技術[10-11]使抗壞血酸的光敏、熱敏穩定性均得到極大的提高，并可以靶向傳遞抗壞血酸后進行釋放，讓機體充分利用抗壞血酸的生物活性。

超支化結構本身具有眾多分支可以作為包埋功能物質的良好載體[12-13]。但目前超支化分子多來自化學單體通過縮聚反應制備獲得，雖然其分支度可控，但化學合成的超支化分子由于安全性大多不適合作為食用壁材。本文采用酶法制備的超支化淀粉分子骨架，研究其作為一種新型的壁材包埋抗壞血酸，以期為功能活性物質包埋、保護提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

高直鏈玉米淀粉，山東諸城興貿玉米開發有限公司；超支化玉米淀粉(HBCS)，實驗室自制[14]；試劑均來自國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

冷凍離心機，真空冷凍干燥機，IS10傅立葉變化紅外光譜儀，美國Nicolet公司；Aduance Ⅲ 400 MHz全數字化核磁共振波譜儀，德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖苷鍵比例測定

采用1H核磁共振測定樣品的α-1,6糖苷鍵比例。參考李雯雯[15]的方法，用重水配制一定濃度的超支化淀粉乳，冷凍干燥后再重新分散于重水中。

1.2.2 超支化淀粉抗壞血酸包合物制備單因素實驗設計

在對不同芯/壁比(質量比)(0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)進行單因素實驗時，準確稱量一定量的超支化淀粉與一定體積的抗壞血酸溶液于磁力攪拌器上混均(表1)，固定溫度30 ℃，溫育時間30 min；在對不同溫度(10、20、30、40、50 ℃)進行單因素實驗時，固定溫芯/壁比(質量比)1∶1，溫育時間30 min；在對不同時間(30、60、90、120、150 min)進行單因素實驗時，固定溫芯/壁比(質量比)1∶1，溫度30 ℃。3 000×g離心5 min，取上清夜測定未被包合的抗壞血酸含量，抽濾、冷凍干燥得到超支化淀粉抗壞血酸包合物，計算相應的包合率。

表1 不同芯/壁比(質量比)配比Table 1 different proportions of core-to-wall ratio

注：CAA/(mg·mL-1)為抗壞血酸質量濃度。

參考HU等[16]的方法并稍作修改。將抗壞血酸溶解于稀醋酸水溶液中配制成不同濃度的溶液，以1%可溶性淀粉溶液作為指示劑用I2/KI溶液滴定待測液。線性回歸方程為：

V(x)=2.012 5X+0.021 7 (R2=0.997 6)

(1)

式中：X為抗壞血酸含量，mg；V(x)為所消耗的VI2/VKI溶液體積，mL。

(2)

式中：m1為包埋的抗壞血酸含量；m0為包合物最大抗壞血酸含量。

1.2.3 超支化淀粉抗壞血酸包合物制備響應面實驗設計

采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面優化設計。在單因素基礎上選取出各因素的最佳范圍值，以包合率為響應值，根據Box-Benhnken中心組合原理設計3因素3水平的響應面實驗(表2)。

表2 Box-Benhnken試驗因素水平和編碼Table 2 Level and code of factors by Box-Benhnken experiment

1.3 傅立葉變換紅外表征

分別取5 mg超支化淀粉、抗壞血酸、超支化淀粉與抗壞血酸物理混合物和超支化淀粉抗壞血酸包合物，按照1∶20的比例加入KBr細粉壓片。以空氣為背景，測定制備好的薄片。紅外掃描波數為4 000～400 cm-1，掃描32次，分辨率為4 cm-1。

1.4 包合物穩定性

1.4.1 光敏穩定性測定

稱取一定量的包合物于去離子水中在30 ℃下100 r/min磁力攪拌，分別在日光下照射30、60、90、120、150和180 min，測定釋放的抗壞血酸含量。以未包合的純抗壞血酸為對照。

1.4.2 熱敏穩定性測定

稱取一定量的包合物于去離子水中，分別在20、30、40、60、80和100 ℃下100 r/min磁力攪拌1 h，測定釋放的抗壞血酸含量，全程注意避光操作。以未包合的純抗壞血酸為對照。

1.5 統計分析

每組實驗均重復3次，實驗結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 17.0對數據進行方差分析，Ducan法進行顯著性分析(p<0.05)，Origin Pro 2016對數據繪圖。

2 結果與討論

2.1 超支化淀粉抗壞血酸包合物制備

2.1.1 超支化淀粉分支度

高直鏈玉米淀粉經過超支化改性后，α-1,6糖苷鍵化學位移在4.99 ppm，α-1,4糖苷鍵化學位移在5.39 ppm(圖1)。超支化淀粉α-1,6糖苷鍵比例由7.08%增加到9.01%，提高了27.26%；其分支度從7.62%提高到9.90%，提高了29.92%(表3)。

圖1 高直鏈玉米淀粉和超支化玉米淀粉糖苷鍵化學位移Fig.1 Chemical shifts of glycosidic bonds of high amylose corn starch (HACS) and hyper-branched corn starch (HBCS)

表3 α-1,6糖苷鍵比例和分支度變化情況Table 3 Changes of ratio of α-1,6 glycosidic bonds and branching degree (BD)

樣品α-1,6 糖苷鍵比例/%BD/%HACS7.08±0.327.62±0.37HBCS9.01±0.479.90±0.57

注：BD分支化度，即α-1,6 糖苷鍵比例與α-1,4 糖苷鍵比例的比值。

2.1.2 單因素實驗結果

芯/壁比對包合物制備的影響在30 ℃下溫育30 min后，芯/壁比對包合率的影響如圖2-a所示。

由圖2-a可知，隨著芯材的不斷增加，包合率不斷提高并趨向平穩。一方面，在濃度差推動下，抗壞血酸的羥基通過氫鍵與超支化玉米淀粉的多分支枝杈附近葡萄糖糖環上的羥基結合；另一方面，超支化玉米淀粉在水溶液中呈現的球形構象松散程度導致枝杈的空腔大小對抗壞血酸包合產生了空間位阻。因此，在30 ℃溫育30 min條件下，抗壞血酸濃度差推動力與超支化玉米淀粉空間位阻逐步達到平衡，隨著抗壞血酸的含量逐漸增加，超支化淀粉的分支枝杈可供包合的空腔逐漸達到飽和，在芯/壁比(質量比)2.5∶1時達到最大包合率5.82%。由顯著性分析可知，芯/壁比2∶1時包合率為5.57%與芯/壁比2.5∶1和3∶1時包合率沒有顯著差異，因此，本著經濟節約的考慮，選擇芯/壁比2∶1為最佳。

溫度對包合物制備的影響在芯/壁比1∶1，溫育30 min條件下，溫度對包合率的影響如圖2-b所示。

由圖2-b可知，隨著溫度的逐漸提高，包合率逐步達到最大值后略微降低。溫度升高，質熱傳遞速率加快，溫度達到40 ℃時，抗壞血酸在順濃度梯度下和空間位阻作用平衡，與超支化淀粉結合達到飽和，包合率為4.85%。然而，隨著溫度的不斷升高，一方面抗壞血酸自身會被氧化成脫氫抗壞血酸和2，3-二酮古樂糖酸，逐漸失去生物活性。另一方面，超支化淀粉、抗壞血酸、溶劑整體體系的熵增，球形構象的超支化淀粉之間的碰撞幾率增加，分子間形成的枝杈空腔不穩定，不利于抗壞血酸的包合。由顯著性分析可知，溫度為30 ℃和40 ℃時，包合率沒有顯著差異，因此選擇溫度30 ℃為最佳。

時間對包合物制備的影響在芯/壁比(質量比)1∶1，30 ℃溫育條件下，時間對包合率的影響如圖2-c所示。

由圖2-c可知，隨著時間的延長，包合率呈現出先上升后下降的趨勢。在包合60 min時達到最大包合率4.82%，隨后包合率逐漸降低，這可能是由于抗壞血酸自身的不斷氧化，或者是由于抗壞血酸在超支化玉米淀粉表面附近內外濃度差的推動下，部分吸附于超支化淀粉表面的抗壞血酸分子被解吸回溶液中。由顯著性分析可知，最佳包合時間為60 min。

a-芯/壁比(質量比)對包合率的影響;b-溫度對包合率的影響;c-時間對包合率的影響圖2 工藝參數對包合率的影響Fig.2 Effect of time to the encapsulation rate

2.1.3 響應面實驗結果

以芯/壁比、時間和溫度為響應變量，包合率為響應值，建立包合工藝模型。實驗結果如表4所示，模型方差分析如表5所示。

表4 Box-Benhnken實驗方案和結果Table 4 Box-Benhnken design and results

續表4

實驗組別芯/壁比(A)時間(B)/min溫度(C)/℃包合率/%62.530304.817260305.078260204.679260305.3110260204.3611260305.07122.590304.92132.590305.23141.530203.51151.530404.00162.530304.4517260305.41

表5 模型方差分析Table 5 Analysis of variances for the model

注:*表示p<0.05，差異顯著。

從圖3可知，在芯/壁比(質量比)固定的情況下，考察時間和溫度交互作用對包合率的影響。響應曲面越陡峭說明包合率對時間和溫度的變化更敏感，同時等高線圖也更加橢圓，反映出交互作用對包合率的明顯變化。

由Box-Benhnken實驗優化得到的工藝參數為芯/壁比1.52∶1(質量比)、時間76.38 min和溫度33.21 ℃，此時包合率達到5.45%。考慮到實際操作的可行性，修正為芯/壁比1.5∶1(質量比)、時間75 min和溫度33 ℃進行驗證實驗，包合率為5.19%，與模型預測包合率相符合。因此，該模型可以較好的評價超支化玉米淀粉與抗壞血酸的包合率。

a-響應曲面;b-等高線圖圖3 時間溫度交互作用對包合率的影響Fig.3 Effect of interaction of time and temperature to the encapsulation rate

2.2 傅立葉變換紅外結構表征

圖4 抗壞血酸、超支化淀粉、超支化淀粉抗壞血酸物理 混合物和超支化淀粉抗壞血酸包合物的紅外光譜Fig.4 The infrared spectra of ascorbic acid (AA), highly- branched corn starch (HBCS), highly-branched corn starch/ ascorbic acid physical mixture (PM) and highly-branched corn starch-ascorbic acid inclusion complex (HBCSAA)

2.3 包合物穩定性

圖5 包合物與純抗壞血酸光熱穩定性Fig.5 Photostability and themostability of highly-branched starch-ascorbic acid inclusion complex and pure ascorbic acid

由圖5可知，隨著溫度的增加和光照時間的延長，包合物與未包合的抗壞血酸穩定性均呈現下降的趨勢。但包合物的穩定性下降程度始終緩于未包合的抗壞血酸穩定性。在溫度100 ℃時，包合物抗壞血

酸穩定性比未包合的高13.88%；當光照180 min后，未包合的抗壞血酸已經完全氧化而包合物還有10.23%的抗壞血酸殘留。因此，超支化淀粉作為壁材可以有效的保護抗壞血酸并提高其穩定性。

3 結論與展望

本研究在最佳工藝條件芯/壁比(質量比)1.5∶1、時間75 min和溫度33 ℃下，制備出超支化淀粉-抗壞血酸包合物，包合率為5.19%。超支化淀粉通過氫鍵與抗壞血酸形成包合物。經包合后，包合物在溫度100 ℃時，抗壞血酸熱敏穩定性提高13.88%，而光照180 min后，其光敏穩定性提高10.23%。后續工作考慮對該包合物進行模擬體外釋放研究，以期考察其是否具有腸胃靶向釋放功能。