子宮內膜癌組織microRNA-944的表達及臨床意義

章麗，張志秀，于愛軍，李明

（山東省德州市人民醫院 1.婦產科，2.病理科，山東 德州 253014）

子宮內膜癌（endometrial carcinoma, EC）是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年升高的趨勢，且患者的預后較差[1]。EC早期患者，在接受根治手術治療后，其5年總存活率可高達96%[2]。然而，EC在發生遠處轉移或者復發后，采用內分泌、放化療的治療效果并不理想，患者的存活率較低[3]。因此，臨床上迫切需要尋找與EC腫瘤形成相關且有助于EC早期診斷、預后預測的分子靶標。微RNAs（microRNAs）為長度約22個核苷酸的非編碼小RNA，在轉錄后水平通過降解mRNA和/或抑制翻譯，負性調控靶基因的表達。MicroRNAs在很多重要的生物學進程中發揮重要作用，如細胞增殖、凋亡、病毒感染及腫瘤發生等[4]。研究證實，在宮頸癌的腫瘤形成和惡性進展過程中，存在多種microRNAs異常表達[5]，然而僅少數microRNAs在宮頸癌中的功能被深入研究。本研究以EC患者的癌組織樣本為研究對象，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測EC癌組織和正常子宮內膜組織中microRNA-944（miR-944）的表達情況，并分析miR-944表達與EC患者臨床病理特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年6月—2015年6月山東省德州市人民醫院80例EC患者的癌組織手術標本。納入標準：①具有完整的病歷資料；②術后病理診斷為EC；③術前均未接受放化療；④無內分泌、免疫和代謝性疾?。虎菪g前6個月內未服用激素類藥物。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②全身感染性疾病；③肝腎疾病。本研究中，＜55歲患者43例，≥55歲患者37例；絕經前患者47例，絕經后患者33例；子宮內膜樣腺癌患者51例，非子宮內膜樣腺癌患者29例；組織分級：G1患者16例，G2患者26例，G3患者38例；肌層浸潤深度≤1/2患者39例，肌層浸潤深度＞1/2患者41例；有淋巴結轉移患者54例，無淋巴結轉移患者26例；有遠處轉移患者49例，無遠處轉移患者31例；國際婦產聯盟（FIGO）分期：Ⅰ、Ⅱ期患者43例，Ⅲ、Ⅳ期患者37例。另收集同期30例子宮肌瘤等良性病變行子宮切除術患者的正常子宮內膜組織作為對照組。所有子宮內膜組織樣本離體后，立即保存于液氮中。本研究獲該院醫學倫理委員會批準，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑與儀器 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自美國Axygen公司，MicroRNAs逆轉錄試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司，cDNA逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，SYBR Green購自德國Roche公司，real-time PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司。Nanodrop分光光度計購自美國Thermo公司，qRT-PCR擴增儀購自德國Roche公司。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-944表達 從液氮中取出組織樣本，迅速置于10 ml離心管中，加入Trizol試劑，以勻漿器高速間斷勻漿，勻漿過程中，離心管置于冰上。Trizol法提取EC癌組織及正常子宮內膜組織中總RNA，操作步驟參照RNA提取試劑盒的說明書。Nanodrop分光光度計檢測總RNA濃度及純度（OD260/OD280比值在1.8～2.0），cDNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，cDNA產物置于-20℃冷凍保存備用。引物序列如下：miR-944正向5'-CGCGAGCAGGAAATTATTGTA-3'，miR-944反 向5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3'；內參 U6正向 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，U6反向 5'-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3'。定量PCR擴增儀檢測miR-944相對表達水平。qRT-PCR擴增體系為10 μl，反應條件：95oC預變性10 s，95oC變性15 s，60oC退火20 s，70oC 延伸 20 s，共 35 個循環。采用 2-ΔΔCt法表示miR-944相對表達量。每個組織樣品進行3次重復試驗后，進行統計分析。

1.3 隨訪

隨訪方式為電話或者門診。隨訪時間為患者術后1～48個月，隨訪終點事件為患者死亡或者到達隨訪截止時間（2017年6月）。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組的比較采用方差分析，兩組的比較采用成組t檢驗。計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，建立Kaplan-Meier生存模型，組間比較采用Log-rank檢驗，采用受試者操作特征（receiver operation characteristic, ROC）曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同子宮內膜組織中miR-944表達情況

EC癌組織中miR-944相對表達量與正常子宮內膜組織比較，差異有統計學意義（t=15.405，P=0.000），EC癌組織（3.29±1.21）高于正常子宮內膜組織（1.02±0.32）。

2.2 EC癌組織中臨床病理特征與miR-944表達的關系

EC癌組織中，miR-944表達與患者的年齡、絕經狀態、病理分型及組織分級無關（P＞0.05）；而與腫瘤肌層浸潤深度、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移及FIGO分期相關（P＜0.05）。在肌層浸潤深度＞1/2組的癌組織中，miR-944表達水平高于肌層浸潤深度≤1/2組（P＜0.05）；有淋巴結轉移組的癌組織中，miR-944表達水平高于無淋巴結轉移組（P＜0.05）；有遠處轉移的癌組織中，miR-944表達水平高于無遠處轉移組（P＜0.05）；在Ⅰ、Ⅱ期組的癌組織中，miR-944表達水平低于Ⅲ、Ⅳ期組（P＜0.05）。見附表。

2.3 EC癌組織中miR-944表達與患者生存率之間的關系

以平均值為界限，將EC患者分為miR-944低表達組（34例）與miR-944高表達組（46例），繪制Kaplan-Meier生存曲線。結果顯示，miR-944高表達組患者的5年總生存率與低表達組患者比較，差異有統計學意義（χ2=8.534，P=0.003），高表達組為54.35%（25/46），低于miR-944低表達組患者的85.29%（29/34）。miR-944高表達組的患者平均生存時間為（50.09±2.03）個月，而miR-944低表達組患者的平均生存時間為（56.03±1.83）個月，Log-rank檢驗結果顯示，miR-944高表達組患者的生存時間較miR-944低表達患者降低（χ2=7.784，P=0.006）。見圖1。

2.4 miR-944表達對患者預測/診斷價值分析

以正常對照組和子宮內膜癌組為樣本，進行miR-944表達水平的ROC分析，分析miR-944表達水平對患者是否具有一定的輔助診斷/判斷價值。約登指數=（敏感性+特異性-1），約登指數最大時對應的miR-944相對表達量，即為鑒別診斷閾值，本研究中的鑒別診斷閾值為1.8，在此閾值點，敏感性為74.3%，特異性為70.8%，ROC曲線的曲線下面積（AUC）為0.784，1-特異性為29.2%，約登指數為0.451。ROC曲線見圖2。

附表 EC癌組織中臨床病理特征與miR-944表達的關系（±s）

臨床病理特征 n miR-944 t/F值 P值年齡＜55歲 43 3.36±1.22 0.522 0.603≥55歲 37 3.22±1.17絕經狀態絕經前 47 3.29±1.24 0.034 0.973絕經后 33 3.30±1.36病理分型子宮內膜樣腺癌 51 3.42±1.45 1.074 0.286非子宮內膜樣腺癌 29 3.07±1.31組織分級G1 16 3.25±1.17 0.641 0.529 G2 26 3.09±1.34 G3 38 3.45±1.24肌層浸潤深度≤1/2 39 2.51±1.37 4.567 0.000＞1/2 41 4.04±1.61淋巴結轉移有54 3.48±1.24 2.100 0.039無26 2.83±1.41遠處轉移有49 3.53±1.46 2.192 0.031無31 2.82±1.33 FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期 43 3.02±1.35-3.069 0.001Ⅲ、Ⅳ期 37 3.71±1.49

圖1 EC癌組織中miR-944表達與患者生存率之間的關系

圖2 ROC曲線

3 討論

EC發病率位居女性惡性腫瘤的第6位，據統計，2012年全球EC新發病例數約32萬[6]。EC是一種高度異質性的惡性腫瘤，且多種危險因素可誘發EC，如高血壓、絕經狀態、不孕癥及家族史等[7]。近年來，對EC診斷和治療方面取得了巨大進展，然而EC晚期患者的預后并不樂觀，其5年總生存率僅10%～29%[8]。在人類腫瘤發生和惡性進展中，存在多種microRNAs的功能異常和表達異常。MicroRNAs可同時具有促癌基因和抑癌基因功能[9]，取決于其下游靶基因的功能，如miR-340在骨肉瘤癌細胞通過靶向沉默ROCK1基因表達，抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，具有抑癌基因功能[10]，而在胃癌細胞中，miR-340則能夠促進腫瘤細胞生長、抑制細胞凋亡，發揮促癌基因的功能[11]。多種microRNAs在EC細胞增殖和凋亡過程中發揮促癌基因或者抑癌基因的功能，如miR-199A-3P[12]、miR-101[13]等。越來越多的證據表明，miR-944參與多種惡性腫瘤的發生和惡性進展過程，本研究關注miR-944在EC癌組織中表達情況及其臨床意義。

首先，qRT-PCR結果顯示，與正常子宮內膜組織相比，miR-944在EC癌組織中表達水平上調，提示在EC腫瘤形成過程中，miR-944可能發揮促癌基因的功能，同時也有研究證實，miR-944在非小細胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer, NSCLC）中靶向下調抑癌基因SOCS4表達，進而促進腫瘤形成，發揮促癌基因功能[14]，然而，miR-944在胃癌[15]、食道癌[16]及結腸癌[17]等腫瘤細胞中發揮抑癌基因功能，可能與腫瘤所屬組織器官差異或者miR-944下游靶基因不同有關。

分析EC癌組織中miR-944表達與EC患者臨床病理特征之間的關系，結果顯示，miR-944在肌層浸潤深度＞1/2、存在淋巴轉移、遠處轉移和Ⅲ、Ⅳ期的癌組織中的表達水平較高，提示在miR-944可能促進了EC癌細胞對周圍組織浸潤、淋巴轉移和遠處轉移，且miR-944具有作為EC早期診斷（Ⅰ、Ⅱ期）指標的潛能。miR-944可能是通過靶向調節與腫瘤浸潤、侵襲及轉移相關的基因表達，進而發揮作用，如XIE等[18]研究證實，miR-944靶向下調抑癌基因S100PBP表達，進而促進宮頸癌細胞侵襲遷移，本研究并未對miR-944促進腫瘤轉移的內在機制進行探究，將在以后的研究中進行探索。

此外，本研究對miR-944表達與EC患者預后的關系進行分析，結果顯示，miR-944高表達的EC患者，其術后5年總生存率和平均生存時間均低于miR-944低表達患者，提示miR-944高表達可能預示著較低的生存率和較短的生存時間，與EC患者不良預后密切相關，miR-944具有作為EC患者不良預后預測的生物靶分子的潛能。HE等[19]在乳腺癌中的研究結果也得到類似的結論，miR-944通過靶向調節BNIP3基因表達，產生獲得性耐藥，miR-944可作為乳腺癌患者不良預后的預測靶標。

最后，miR-944表達水平的ROC分析，結果提示：當miR-944表達水平在1.8（ROC分析所得閾值）以上時，患者EC的陽性率提高。提示其可作為判斷EC的輔助證據，ROC曲線下面積AUC值較高（0.784），敏感性和特異性也較好。董動麗等[20]的研究結果表明，血清HE4和CA125診斷EC的敏感性分別為54.67%和28.00%，特異性分別為98.57%和91.43%，與之相比，本研究中miR-944診斷EC的敏感性較高，而特異性偏低。當然，由于本研究的實驗樣本量較少，可能會導致結果出現一定的偏倚，在后續的研究中應擴大樣本量，以得到更加可靠、準確的結論。

綜上所述，本研究結果證實，miR-944在EC癌組織中呈高表達狀態，且miR-944高表達預示著患者可能發生肌層浸潤、淋巴結轉移及遠處轉移，并且與患者較低的術后5年總生存率和較短平均生存時間相關，提示miR-944參與并促進了EC腫瘤形成和惡性進展，miR-944可作為EC早期診斷和預后預測的潛在靶點。