心腦舒通膠囊對氧糖剝奪/復氧星形膠質細胞神經營養因子分泌的影響及對神經元的保護作用*

李芮琳 ，劉文杰，袁 慶 ，張 彤 ，徐 耀，胡利民 ，柴麗娟

（1．天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 300193；2．方劑學教育部重點實驗室，天津 300193；3．天津市中藥藥理學重點實驗室，天津 300193）

星形膠質細胞是中樞神經膠質細胞中數量最多功能最復雜的一類細胞[1]。近年來的研究發現，星形膠質細胞除有維持血管、神經元胞體、軸突和突觸結構穩定的功能外[2]，還有分泌神經營養因子，如腦源性神經營養因子（BDNF）、膠質源性神經營養因子（GDNF）、睫狀神經營養因子（CNTF）等的功能[3]。BDNF、GDNF、CNTF 對氧糖剝奪/復氧（OGD/R）處理后神經細胞的存活、分化及神經再生、空間認知能力等方面起重要作用，對腦缺血缺氧所致的腦損傷有保護作用，可促進周圍神經損傷的軸突生長、髓鞘的形成和突觸形成[4-5]。

心腦舒通膠囊的主要成分為蒺藜總皂苷，具有活血化瘀，舒利血脈等生理活性，主要用于中風恢復期半身不遂、語言障礙等心腦血管缺血性疾患[6]。本實驗通過建立可靠的體外OGD/R損傷模型，研究心腦舒通對星形膠質細胞的影響及對神經營養因子表達的影響，以及經心腦舒通處理的星形膠質細胞條件培養液對神經元存活的影響。初步探討心腦舒通的神經保護作用，為臨床用藥提供一定的理論依據。

1 材料

1.1 實驗細胞 星形膠質細胞株C8-D1A（武漢大學細胞保藏中心）；Neuro-2A神經元細胞（美國ATCC公司）。

1.2 實驗儀器及試劑 心腦舒通膠囊（吉林敖東有限公司，批號為Z22021965）；MEM培養基（美國Corning公司，批號為10-022-CVR）；胎牛血清（美國 BiologicalIndustries公司，批號為 1552680）；0．25%胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號為1894156）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學公司，批號為CK04）；酶免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢華美生物，批號分別為 CSB-E04501h、CSB-E04566r、CSBEL005683CH）；CO2恒溫培養箱（美國 Thermo公司）；低溫高速離心機（美國Beckman公司），多功能讀板機（瑞士Tecan公司）；缺氧小室（加拿大Stemcell公司）。

2 方法

2.1 藥物配制 準確稱量心腦舒通膠囊中的藥粉質量，用細胞培養液配制成10 mg/mL濃度，用0．75 μm一次性過濾器過濾藥液，之后用細胞培養液稀釋為不同濃度的工作液。

2.2 小鼠膠質細胞株C8-D1A、神經元細胞株Neuro-2A的培養 復蘇C8-D1A膠質細胞株，MEM全培基（10%胎牛血清；1%丙酮酸鈉；1%雙抗）培養，待細胞生長至匯合后用0．25%胰酶消化傳代。待細胞穩定3～4代后用于實驗。每4～5日細胞傳代1次。

復蘇Neuro-2A神經元細胞株，MEM全培基（MEM，10%胎牛血清，1%雙抗，2 mmol/L的L-谷氨酰胺）培養，待細胞生長至匯合后用0．25%胰酶消化傳代。待細胞穩定3～4代后用于實驗。每4～5日細胞傳代1次。

2.3 對正常培養膠質細胞活力的影響 將生長穩定的C8-D1A種植于96孔板，細胞覆蓋約60%時，置換細胞培養液為含有不同濃度心腦舒通（10pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL、10 μg/mL）的無血清 MEM 培養基孵育24 h，培養24 h棄去培養液，加入CCK-8后于450 nm處測定吸光度，記錄數據進行統計分析。

2.4 對氧糖剝奪/復氧處理膠質細胞活力的影響 將生長穩定的C8-D1A種植于96孔板，細胞覆蓋約60%時，棄去原培養液，用無糖KRP緩沖液洗滌細胞2次后加入無糖KRP緩沖液放入缺氧小室中，而后將缺氧小室中充注95%N2+5%CO2，密封放入37℃、5%CO2培養箱培養4 h。4 h后將KRP置換為含有不同濃度心腦舒通（0 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL、10 μg/mL）無血清MEM培養基孵育，0 pg/mL為模型組（Mod）；對照組（Con）用含糖KRP緩沖液清洗細胞2次后，加入含糖KRP緩沖液，放入37℃、5%CO2培養箱正常孵育4 h，而后加入無血清全培進行培養。培養20h后棄去培養液，CCK-8法測定細胞活力，多功能讀板機450 nm波長處測定吸光度。

2.5 對體外OGD/R膠質細胞神經營養因子（BDNF、GDNF、CNTF）釋放的影響 將生長穩定的C8-D1A細胞種植于24孔板，待細胞覆蓋約80%時，細胞按上述步驟進行OGD/R及加藥處理。48 h后收集細胞上清液，3 000 r/min，15 min，25 ℃離心，吸取上清液于新的200 μL離心管中。參照ELISA試劑盒相關操作說明進行操作，均在540 nm波長處測定吸光度，記錄數據進行統計分析。

此部分膠質細胞培養上清液同時也收集備用為膠質細胞條件培養液，用于后續對OGD/R神經元細胞保護作用的研究。細胞分組如下：正常對照組（Con）、模型組（Mod）、心腦舒通不同濃度組（0．1、1、10 μg/mL）。

2.6 心腦舒通處理C8-D1A細胞條件培養液對OGD/R神經元的保護作用 將Neuro-2A細胞用神經元完全培養液（MEM，10%胎牛血清，1%雙抗，0．5%L-谷氨酰胺）懸浮，以 6．25×104個/cm2接種于96孔板中，待細胞生長融合約80%時，進行實驗。按2．3步驟對Neuro-2A細胞進行OGD/R處理，模型組在復氧的同時加入經心腦舒通處理過的膠質細胞條件培養液培養20 h后，CCK-8法測定神經元細胞活力。細胞具體分組如下：正常對照組（Con）、模型組（Mod）、不同濃度心腦舒通處理膠質細胞條件培養液組（0．1、1 和 10 μg/mL）。

2.7 統計學分析 所有實驗數據采用SPSS 19．0進行統計處理，組間差異性比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 心腦舒通對正常及OGD/R損傷C8-D1A細胞活力的影響 見圖1（A），與對照組相比，心腦舒通在不同濃度范圍內對正常培養C8-D1A細胞活力均沒有影響，表明實驗所選用心腦舒通的各濃度對膠質細胞均無毒副作用。

見圖1（B），與對照組相比，模型組及心腦舒通不同濃度組均能提高OGD/R損傷C8-D1A細胞的增殖。與模型組相比，心腦舒通在10 μg/mL時對OGD/R損傷的C8-D1A細胞有保護作用。

3.2 對OGD/R損傷的C8-D1A細胞BDNF、GDNF、CNTF合成分泌的影響 從圖2可以看出，與對照組相比，模型組BDNF有少許升高，不同濃度心腦舒通可以顯著促進OGD/R損傷C8-D1A細胞BDNF的釋放。與模型組相比，心腦舒通0．1 μg/mL可以顯著提高膠質細胞BDNF的釋放。與對照組相比，模型組膠質細胞GDNF、CNTF的分泌釋放有升高趨勢，但不具有統計學差異。與模型組比較，不同濃度心腦舒通對OGD/R損傷C8-D1A細胞BDNF的分泌促進作用也不明顯。

3.3 心腦舒通處理膠質細胞條件培養液對OGD/R損傷神經元的保護作用 從圖3可以看出，與對照組比較，來源于膠質細胞模型組的條件培養液顯著降低了OGD/R神經元的細胞活力，顯著抑制了神經元細胞的活力。而用心腦舒通處理過的膠質細胞條件培養液培養缺氧復氧的神經元20 h后，0．1 μg/mL心腦舒通可以明顯提高OGD/R神經元的存活能力。

圖2 心腦舒通對OGD/R膠質細胞BDNF、GDNF、CNTF釋放的影響（n=6）Fig.2 Effects of Xinnao Shutong on the release of BDNF,GDNF and CNTF from OGD/R astrocytes（n=6）

圖3 心腦舒通處理的膠質細胞條件培養液對神元細胞的保護作用（n=18）Fig.3 Protective effect of conditioned medium of glial cells treated with Xinnao Shutong on neurons（n=18）

4 討論

神經營養因子在缺血性腦損傷的發生和發展方面有著重要作用，腦缺血可導致神經元凋亡甚至死亡[7]。研究表明，腦缺血再灌注損傷中，反應性星形膠質細胞分泌BDNF、GDNF、CNTF等的能力增強，并通過分泌這些神經營養因子來促進神經元的修復和再生[8]。郭大志等[9]通過實驗表明，BDNF可通過抵抗一氧化氮（NO）介導的谷氨酸細胞毒性和抑制細胞凋亡來保護神經元，從而減少缺血性腦損傷。GDNF不僅能提高神經元抗損傷能力，并且具有促進軸突生長作用[10]。在神經系統發育過程中，CNTF作為促進膠質細胞和神經元存活和分化的一種營養因子，對膠質細胞和神經元起到保護作用[11]。

從實驗結果可以看出，心腦舒通對正常培養膠質細胞系C8-D1A細胞活力沒有顯著影響，但可以提高OGD/R的膠質細胞增殖，其中10 μg/mL時對OGD/R后的C8-D1A膠質細胞有明顯促增殖作用。另外，心腦舒通在0．1 μg/mL時可以顯著提高OGD/R后膠質細胞BDNF的釋放，而對具有抵抗缺血損傷能力的GDNF、CNTF因子來說，心腦舒通對其釋放量均無顯著影響。從心腦舒通處理的膠質細胞條件培養液對OGD/R損傷神經元的作用結果看，與對照組比較，模型組條件培養液顯著降低損傷神經元的細胞活力，表明星形膠質細胞的過度活化可能參與促進缺血后神經細胞的損傷過程，從而加重了神經細胞的損傷。而心腦舒通在0．1 μg/mL時可以顯著提高損傷后神經元的活力，該保護作用有可能是通過膠質細胞釋放BDNF而發揮作用。

總之，本研究表明心腦舒通可以促進OGD/R損傷后的膠質細胞增殖及生長因子的釋放，促進OGD/R損傷神經元的存活，為臨床治療提供了一些理論依據，但其機制有待進一步的深入研究。