常壓室溫等離子體誘變選育春雷霉素高產菌株

高嫚妮 潘忠成 楊玉旺 楊宏勃 陳豪 翁婧 李蒲民

摘要：采用常壓室溫等離子體對春雷霉素生產菌株小金色鏈霉菌（ Streptomyces mlcroaureus） 203#進行誘變育種，采用不同時間等離子體照射誘變，再經過瓊脂塊篩選、搖瓶初篩和復篩，獲得2株春雷霉素高產菌株，搖瓶效價分別為5012 μg/mL和4034 μg/mL，相比原始出發菌株203的效價提高了147%和98%。關鍵詞：小金色鏈霉菌;效價;誘變選育;春雷霉素;常壓室溫等離子體中圖分類號：TQ455.5

文獻標識碼：A

文章編號：16 74-9944（ 2019） 24-0001-04

1 引言

近年來，隨著人們環保意識的加強，生物農藥逐漸走人人們的視野。其專一性強，活性高，安全環保，不易產生殘留和抗藥性，對我國農業避免藥害、合理用藥、減緩病害抗藥性、提高防治效果、減少農藥殘留有著重要意義。春雷霉素不僅能防治水稻稻瘟病[1]，對番茄葉霉病[2，3]、黃瓜細菌性角斑病[4，5]、白菜軟腐病[6]等也具有抗菌作用。春雷霉素作為高效、廣譜、低毒、無公害的生物農藥，被農業部列為無公害農產品生產推薦農藥，展示了越來越光明的市場前景。

春雷霉素是屬于氨基糖苷類抗生素，其產生菌為小金色鏈霉菌。菌種的高產和發酵工藝的優化關系到一個發酵行業的靈魂，能獲得一株高產、穩定、適應性好的菌株，將會大大縮短產業化的路程。采用等離子體誘變和紫外照射誘變是目前常采用的有效誘變手段，以此來篩選抗生素高產菌株已廣泛用于菌株選育程序中[7]。多殺菌素產生菌經過紫外誘變，篩選高產菌株已有研究報道[8]。汪晨等[9]以谷氨酸棒桿菌作為原始出發菌株，通過常壓室溫等離子體誘變技術，確定高產琥珀酸等離子體誘變的物理參數和最佳誘變條件，篩選得到具備良好的產琥珀酸與有機酸的能力的誘變菌。蔡聰等[1O]為進一步提高凝結芽孢桿菌發酵木糖生產L一乳酸的產量和轉化率，以實驗室保存的一株能利用木糖產L一乳酸的野生型凝結芽孢桿菌菌株NLOI為出發菌株，通過等離子體誘變育種技術和平板菌落初篩、搖瓶復篩，最終得到一株木糖耐受力強、L一乳酸產量高、遺傳特性穩定的正向突變菌株NL- CC- 17。常壓室溫等離子體（ ARTP）誘變篩選高乳糖酶活力乳酸克魯維酵母的條件，以ARTP誘變育種方法為誘變手段，對乳酸克魯維酵母進行不同時長（10 s依次增加到300 s）的誘變處理，并結合高通量篩選方法快速篩選出33株乳糖酶活力提高50%以上的突變菌株。通過復篩最終得到4株高乳糖酶活力的突變菌株[11.12]。白云[13]通過響應面的培養基的優化實現了多殺菌素發酵產量的有效變化，除菌株的高產特性外，菌株的適應環境的能力同樣非常重要。

2 實驗材料

2.1 實驗儀器

常壓室溫等離子體誘變育種儀（ ARTP）：無錫源清天木生物科技有限公司;HZQ- X500C大型恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司;恒溫恒濕箱：上海恒一科學儀器有限公司;LC-2030高效液相色譜儀：株式會社島津制作所。

2.2 實驗菌種

春雷霉素產生菌小金色鏈霉菌（Streptomyces ml-croaureus），由陜西麥可羅生物科技有限公司提供。

3 實驗方法

3.1 小金色鏈霉菌斜面培養制備和斜面孢子計數

用接種鏟將出發菌株接種到斜面培養基（葡萄糖1.0%，麥芽糖0.5%，蛋白胨0.1%，氯化鈉0.1%，豆餅粉5.0%，碳酸鈣0.1%，瓊脂2.0%，其余水，pH自然，121℃滅菌20 min）上25～30℃培養9d，獲得孢子斜面，再刮下斜面全部孢子，用滅菌生理鹽水稀釋108倍，涂布在含培養基（同斜面培養基相同組分）平皿上，28℃培養3d，單菌落計數，依據稀釋比例計算斜面孢子總數。

3.2 小金色鏈霉菌常壓室溫等離子體（ ARTP）誘變處理

用接種鏟鏟取整個斜面孢子，加入含10 mL生理鹽水的50 mL試管中，加入40顆玻璃珠，震蕩4 min，用滅菌脫脂棉過濾去除菌絲片段，制成大濃度孢子懸液。再用滅菌生理鹽水稀釋至孢子濃度約為106個/mL。孢子懸液中加終濃度為5%滅菌甘油，混合均勻，取10μL涂于無菌載片上，距離照射源2 mm，分別照射O s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s、120 s、130s、140 s、150 s、160 s、170 s、180 s，立即分別稀釋O倍、10倍、1000倍、10000倍、100000倍，取100 μL均勻涂布于平皿上，黑暗靜止培養6～10 d，獲得單菌落。

3.3 春雷霉素高產菌株篩選

3.3.1 瓊脂塊法篩選誘變后菌株

制備雙層平板，將滅菌后的下層培養基15 mL趁熱倒入平板中，冷卻30 min。上層培養基溫度降至50℃左右，加入10%的春雷霉素指示菌枯草芽孢桿菌，輕搖混勻，取15 mL迅速鋪于已制備好的下層培養基上，繼續冷卻至室溫。用接種針挑取誘變后的單菌落，輕置于培養基上，37℃培養28 h，通過考察抑菌圈大小篩選出產春雷霉素的能力強的單菌落。

下層培養基：瓊脂1. 5%，其余為水，pH自然。上層培養基組分：蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化鈉1.0%、瓊脂1.5%，其余為水，pH自然。

3.3.2 搖瓶發酵法篩選誘變菌株

初篩：從平板上挑選抑菌圈大的單菌落接種至斜面培養基上，28℃培養9d，獲得孢子斜面。用接種鏟從斜面將孢子接種到種子培養基（豆餅粉5. 0%，飴糖0. 5%，磷酸二氫鉀0.1%，氯化鈉0.5%，玉米油5.0%，其余為水，pH自然）中，28℃，200 r/min搖床震蕩培養培養24 h，按2% （v/v）的接種量立即轉接至發酵培養基（黃豆餅粉5.0%，磷酸二氫鉀0.50%，氯化鈉0.5%，玉米油5.0%，其余為水，pH自然。）中，繼續進行發酵培養170 h，獲得含不同濃度春雷霉素發酵液。

采用高效液相色譜分析方法測定發酵液中春雷霉素的含量，所用色譜條件：5 μm ODS不銹鋼柱;流動相：乙腈一1. O%SDS水溶液（體積比20：80）;流速：1.2mL/min;可變紫外檢測器：波長215 nm。依據峰面積計算發酵液中春雷霉素的含量，并選取含量高于對照10%的菌株進行復篩。復篩：重復初篩操作，對初篩的高效菌株進行復篩，最終篩選出春雷霉素高產菌株。

3.3.3 春雷霉素高產菌株的傳代穩定性考察

將篩選出來的高產菌株轉接至斜面培養基，在28℃恒溫干燥培養箱中避光培養9d，對斜面菌種再次轉接至斜面培養基上，重復操作5次。分別將這六次培養獲得的斜面菌株接種至種子培養基中，28℃，220 r/min搖床震蕩培養培養40 h，按2% （v/v）的接種量立即轉接至發酵培養基中，繼續進行發酵培養170 h，獲得含不同濃度春雷霉素發酵液，采用HPLC測定發酵液中春雷霉素的含量。

4 結果分析

4.1 小金色鏈霉菌斜面培養制備和斜面孢子計數

用接種鏟將帶菌斜面全部鏟進10 ml_無菌蒸餾水中，經稀釋涂布，菌落計數，發現一個帶菌斜面含有孢子數約為2.5×10⁹個。

4.2

ARTP誘變選育高產菌株

4.2.1ARTP誘變處理春雷霉素產生菌的存活率

通過對孢子懸液不同誘變照射時間（O s、40 s、50s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s、120 s、130 s、140 s、150 s、160 s、170 s、180 s）后，孢子存活率分別為100%、1. 36%、1.27%、0.84%、0.55%、0.04%、0.01%、0. 03%、0.25%、0.55%、0.98%、1.37%、1.29%、1.04%、0.71%、0%。由此可見孢子存活率隨著照射時間延長，存活率先減小在增大再減小，似馬鞍形分布。

4.2.2 篩選高產菌株

通過對ARTP不同照射時間孢子培養，瓊脂塊及搖瓶篩選，共選出2株春雷霉素高產菌株，搖瓶效價分別為5012 U/mL和4034 U/mL，相比原始出發菌株203效價提高了147%和98%。

5 討論

小金色鏈霉菌經ARTP誘變不同時間，孢子存活率均高達70%以上，且存活率呈馬鞍形分布，誘變照射后的孢子懸液在含碳酸鈣平皿上稀釋涂布，發現單菌落形態相似，主要呈饅頭型、草帽型和車輪型，且單菌落周邊出現直徑大小各異的透明圈。經最終瓊脂塊篩選和搖瓶篩選，發現單菌落的形態與單菌落發酵后發酵液的效價沒有直接關系，但單菌落在含碳酸鈣的培養基上培養9d后的透明圈大小與單菌落發酵后的發酵液效價在一定條件下呈正相關，但也有個例不符合此規律。實驗篩選出的這兩株高產菌株分別是ARTP照射60 s和140 s孢子懸液，篩選出來的。因此，對春雷霉素生產菌株孢子誘變篩選高產菌株時，優先照射時間選擇60 s和140 s。

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收稿日期：2019-11-23

基金項目：陜西省科技廳項目（編號：2018ZKC- 173）;陜西省科技廳項目（編號：2019-PT-15）;渭南市科技局項目（編號：ZDYF- SFGG- 17 -ZSG）;渭南市工業公關項目（編號：2019ZDYF- GYGG 31）;陜西省科技廳重大項目（編號：S2018- YF-ZDNY-0199）;陜西省科協企業創新爭先青年人才托舉計劃項目（編號：2018-1-2）

作者簡介：高嫚妮（1988-），女，碩士，研究方向為應用微生物及生物醫藥。

通訊作者：潘忠成（1974-），男，博士，研究方向為應用微生物及生物醫藥。