油菜素內酯對小麥幼苗根系發育的影響

鄧 茜，張愛華，侯立江，王 丹，許盛寶

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上重要的糧食作物之一，保障小麥高產穩產是我國乃至全世界當前重要的課題。小麥根系在其整個生長發育過程中扮演著非常重要的角色，特別是早期根的數目、總根長和側根的數目，對于小麥產量影響較大[1-2]。

油菜素內酯(brassinolide, BL)是活性最強的一種甾醇類植物激素(brassinosteroids,BRs)[3-7]。BRs參與植物一系列的生長發育過程，如胚根和胚軸的伸長、葉片伸展、基因表達調控、開花和結果、細胞程序性死亡等，最典型的就是作用于細胞的伸長和分裂[3-4]，以及參與植物對各種生物或非生物脅迫耐受過程[5-6]。在擬南芥中，BRs不僅參與根細胞伸長，而且還參與根系發育的許多方面，例如根毛形成、側根起始、菌根形成、根細胞分裂和根分生組織原生韌皮部的分化[8-9]。目前，關于BRs對小麥根系影響的研究較少，限制了其在小麥中的應用。研究表明，BRs對小麥種子的萌發[10]、幼苗抗冷性[11]、抗旱性[12]以及萌發期間抗鹽性[13]具有重要的調控功能。在小麥孕穗期和灌漿期，噴灑低濃度BL可以增強植株抗青枯能力，降低不育小穗數，提高結實率和粒重[14]。BL浸種可促進小麥根和胚芽鞘的伸長，并增加干物質量[15]。先前的研究也觀察到，BRs對小麥根系發育有調控功能[16]。此外，在小麥根系發育中，細胞伸長和增殖是緊密相關的，而BR對細胞增殖的影響更為突出[17-19]，但需要系統的研究來闡明BR在小麥根系發育中的具體功能，從而促進油菜素內酯在小麥根系改良中的應用。

本研究通過水培方法探究了不同濃度的BL及BRs合成抑制劑BRZ對小麥幼苗根系的形態、長度、直徑和側根原基、側根及其長出速率的影響，以期解析BRs在小麥根系發育的調控功能，為利用BRs的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥(TriticumaestivumL.)品種為中國春和遼春10號。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 小麥幼苗的水培

精選飽滿種子在蒸餾水中浸泡5～8 h，用消毒液(綠傘)對種子進行表面消毒(消毒液∶蒸餾水=3∶2)5～6 min，然后用蒸餾水沖洗5～7次。在滅菌的培養皿(直徑15 cm)中鋪兩層濾紙，加入5 mL蒸餾水潤濕，將沖洗干凈的種子均勻地擺放在濾紙上，再緩慢加入15 mL蒸餾水，蓋上蓋子，置于4 ℃ 條件下春化24 h。然后在白天 23 ℃、晚上 20 ℃、光/暗時間14 h/10 h、光強 110 μmol·L-1·m-2·s-1、濕度 60%～70% 的光照培養箱中培養，大概 12 h 后露白，培養2 d 后將長勢一致的幼苗作為實驗所用材料，并移至發芽盒(12 cm×12 cm)。每個發芽盒中放20株，發芽盒用保鮮膜覆蓋，在保鮮膜上戳孔，以保證小麥的根系可以正常的呼吸。

1.2.2 小麥幼苗的處理

發芽盒中恢復生長一天后，開始用不同濃度BL(0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1)和BRs合成抑制劑BRZ(100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1)處理。每種處理設置 3 次重復，每次重復取15～20株長勢一致的幼苗進行觀察和測定，處理溶液每 2 d更換1次。所有處理均放置于光照培養箱中，培養條件同上。

1.2.3 亞甲基藍染色

將切下的根固定在無水乙醇∶冰醋酸溶液(3∶1，v/v)中，4 ℃下至少24 h；之后用蒸餾水漂洗5 min，并浸泡在次氯酸鈉溶液(5%，v/v)中抽真空10 min，再置于大氣下 10 min；倒掉次氯酸鈉溶液，用蒸餾水清洗干凈；最后用亞甲基藍(0.01%，溶解于蒸餾水中)染色[20]。經過亞甲基藍染色的小麥幼苗，側根和側根原基處顯色會明顯加深，便于觀察和統計。

1.2.4 試劑

試驗所用的BL和BRZ均購買于上海Sigma-Aldrich公司。BL 用乙醇配成 10 mmol·L-1的母液，根據需要按一定的比例用蒸餾水稀釋配成濃度為 0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1的使用液，其中0 nmol·L-1是對照；BRZ 用DMSO配制成 10 mmol·L-1的母液，其使用濃度為 100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1。

1.4 幼苗根系的觀察與測定

用BL和BRZ 處理 10 d后，觀察小麥幼苗根系的外形，并用數碼相機(Canon eos 600d)對小麥幼苗的根系進行拍照，并用 Image-J軟件測量小麥幼苗最長的根長。每個處理統計 20 株種苗并求平均值，每個處理重復 3 次。

小麥種子根經亞甲基藍染色后，在體視顯微鏡(Nikon SMZ1500)下觀察并記錄側根數目，每個處理統計 20 株幼苗并求平均值，每個處理重復 3 次。在距小麥幼苗根尖 1 cm 位置處徒手切片，并在ZEISS生物熒光顯微鏡(Imager M2)下觀察、拍照，測量其直徑。由于在本實驗時期小麥幼苗根系數目在5～7根之間，所以小麥幼根初始原基數目及其長出速率測定時均將小麥最中間的三個根作為統計對象。側根原基長出速率用同一時間點已長出的側根與初始側根原基數目的比值來表示。

1.5 數據處理

試驗數據均用Microsoft Excel 2010進行整理、分析和作圖，用SPSS 17.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 BL對小麥幼苗根形態的影響

在不同濃度BL和BRZ處理后，小麥幼苗地上部分形態沒有明顯的變化，但是根系形態發生了嚴重扭曲，根長、根直徑和側根數目也發生不同程度的變化(圖1)。

2.2 BL對小麥幼苗根長的影響

低濃度BL促進了小麥幼苗根系伸長，但高濃度BL抑制了小麥幼苗根系生長(圖2A和圖2B)。其中，中國春的根長在5 nmol·L-1BL處理下較0 nmol·L-1處理(對照)極顯著增加，但是BL濃度增加至100 nmol·L-1和1 μmol·L-1時，根長的生長又受到極顯著的抑制。100 nmol·L-1和1 μmol·L-1BRZ處理對中國春根長沒有顯著影響，直到BRZ濃度增加到10 μmol·L-1時中國春幼苗根系的伸長才被明顯抑制。遼春10號受BL和BRZ影響的趨勢和中國春基本一致。

植物根系的生長主要是因為分生區細胞的分裂和伸長區細胞的擴張[21]。不同濃度BL及BRZ處理對兩個小麥品種的幼苗根長均產生了影響。不同處理下兩個小麥品種幼苗的成熟細胞長度和根長的表現基本一致(圖2C和圖2D)。在5 nmol·L-1BL處理下成熟細胞長度最大，與對照相比顯著增加；但是根分生區域的細胞長度隨著BL濃度的增大受到的抑制越來越嚴重(圖2E和圖2F)。由此可知，BL主要通過調控根成熟細胞長度來影響小麥幼苗根系長度。

1～5 分別表示0 nmol·L-1、5 nmol·L-1、25 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1BL處理；6～8 分別表示100 nmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1BRZ處理。下圖同。

1～5 represent BL concentrations of 0 nmol·L-1, 5 nmol·L-1, 25 nmol·L-1, 100 nmol·L-1and 1 μmol·L-1, respectively, and 6～8 represent 100 nmol·L-1, 1 μmol·L-1and 10 μmol·L-1BRZ, respectively. The same in the other figures.

圖1不同濃度BL和BRZ處理對小麥幼苗生長發育的影響

Fig.1EffectsofdifferentconcentrationsofBLandBRZongrowthanddevelopmentofwheatseedlings

2.3 BL對小麥幼苗根尖解剖結構的影響

從小麥幼苗根尖的橫切結構(圖 3)看，與對照相比，BL處理濃度越大，根系直徑越小；而不同濃度BRZ處理均使根系直徑增加。根尖維管柱內分化出木質部，且皮層細胞層次清晰、排列整齊，內皮層細胞“馬蹄”型加厚非常明顯，維管柱的結構與對照沒有特別明顯的差異(圖 3A和圖3C)；兩個品種根細胞大小出現了很明顯的差異。根據以上結果推測，BL可能通過影響根系皮層細胞大小來影響小麥幼苗根的粗細。

2.4 BL對小麥幼苗側根數目的影響

在BL處理下中國春和遼春10號幼苗的側根數目與對照均存在肉眼可見的差異(圖1、圖4A和圖4B)。隨著BL處理濃度的增加，兩品種幼苗的側根數目均極顯著增加(圖4C和圖4D)；BRZ總的說來會抑制幼苗側根數目。其中中國春側根數目在100 nmol·L-1BL處理下最多，而遼春10號在5 nmol·L-1BL處理下最多。

圖柱上的大小寫字母分別表示處理間差異在0.01和0.05水平上顯著。下圖同。

Different capital and lower-case letters mean significantly different among the treatments at 0.01 and 0.05 levels. The same in figures 3-5.

圖2不同濃度BL和BRZ處理對小麥幼苗根長、成熟細胞長度和根分生區長度的影響

Fig.2EffectsofdifferentconcentrationsofBLandBRZonrootlength,maturecelllengthandrootmeristemsizeofwheatseedlings

2.5 BL對小麥幼苗側根原基及其長出速率的影響

側根的數目決定于側根原基起始數目及側根原基長出的速率[22]。由圖5A和圖5B可知，中國春的幼苗用100 nmol·L-1及以下濃度的BL處理時，其起始側根原基數相比于對照顯著增加，但是當BL濃度增加到1 μmol·L-1時，其起始側根原基數顯著減少；而遼春10號的幼苗只有在5 nmol·L-1BL處理時起始側根原基數顯著增加，當BR濃度上升至100 nmol·L-1時，開始出現抑制；用BRZ處理時，兩個品種基本無明顯變化。兩個品種的測定結果表明 BL作用于側根原基起始過程，可以增加起始側根原基數目，而且遼春10號比中國春對BL更加敏感。雖然起始原基數目顯著增加，但是考慮到側根原基突破主根表皮之后才算是側根，所以本研究對整個主根進行側根原基長出率的統計和計算(圖 5C和圖5D)。經過BL處理后小麥幼苗的側根原基長出比例會顯著提高，說明適宜濃度BL會促進小麥側根原基的形成，加快側根原基突破主根皮層的速度，從而使側根數目增加。

圖3 不同濃度 BL 和 BRZ 處理對小麥幼苗根系直徑的影響Fig.3 Effects of different concentrations of BL and BRZ on root diameter of wheat seedlings

3 討 論

植物根系是獲得養分的關鍵，根系的形態調整是植物適應環境的重要策略，對于農業生產意義重大。小麥是典型的須根系植物，沒有主根，根系由初生根和次生根以及其上著生的各級側根構成，側根分枝可以達到6級，是小麥根系的主要組成部分[23]。根長及側根的分布對于確定根系統結構至關重要，直接關系到根系對不同土層水分與養分的吸收。近年來，單子葉植物相應研究也陸續開展，尤其是水稻根系的相關研究，并取得了一定的進展，但目前有關BR對小麥根系的研究還鮮有報道[24-25]。

本研究發現，BRs對小麥幼苗地上部分的影響不明顯，但對根系生長發育卻具有明顯效應，這可能與該研究采用水培實驗方法相關。此外，BRs對小麥種苗根系效應呈現明顯的濃度梯度，即低濃度促進，高濃度抑制。本研究中，促進根長生長的最適濃度為5 nmol·L-1，超過該濃度時，根長的抑制現象逐漸嚴重；低于此濃度時，對小麥根長有促進效應，但同時會造成根系形態異常，這均與前人的研究結果基本一致[26-27]。

本研究首次報道了BRs對小麥根系直徑具有顯著效應，并通過切片技術進行了細胞學分析，這在其他植物研究中均未有相應的報道，其是否為小麥等禾本科特有的調控，或是外源BL處理帶來的表型，仍需要進一步的證實。本研究結果表明，BRs對于小麥幼苗側根數目也表現出低促高抑的現象，適宜濃度處理下(中國春為100 nmol·L-1, 遼春10號為5 nmol·L-1)，幼苗側根數目均極顯著的增加，但不同小麥品種對BR的敏感性明顯不同，因此其對應的最適濃度也存在差異；當濃度高于1 μmol·L-1時，BRs則對小麥側根數目產生抑制作用，與Gupta之前在擬南芥上的研究結果相近[28]。此外，在適宜濃度的BRs處理下，除了起始側根原基的數目增加，小麥側根原基生長速率也顯著提高，這和本實驗室前期在擬南芥上的研究結果一致，說明BRs可能通過正向調控一種絲氨酸羧肽酶BRS1使植物側根原基更容易突破根皮層，使側根原基生長速率增快，從而使植物的側根數目顯著增加[29]。

圖4 不同濃度 BL 和 BRZ 處理對小麥幼苗根數目的影響Fig.4 Effects of different concentrations of BL and BRZ on root number of wheat seedlings

根據兩種小麥品種的對比可知，不同小麥品種響應BR信號途徑和強弱可能有所差異，具有遺傳多樣性。外源施用BRs時，對于不同的品種可能需要考慮不同的最優處理濃度。此外，雖然實驗室結果表明油菜素內酯可用于小麥幼苗根系生長的調節，但其對于大田小麥的作用效果和具體作用機制，還有待于進一步研究。

圖5 不同濃度 BL 和 BRZ 處理對小麥幼苗側根發育的影響Fig.5 Effects of different concentrations of BL and BRZ on lateral roots development of wheat seedlings