嘉陵江合川段秋季微生物多樣性研究

但 言，沈子偉，余鳳琴，張 闖 ，倪朝輝，黎 春

(1.重慶市水產科學研究所，重慶 401120 2.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業部長江中上游漁業資源環境科學觀測實驗站，武漢 430223 3.重慶市巫山縣農業委員會，重慶巫山 404700)

水是維持人和動物生命及漁業、工農業生產的最基本也是最重要的資源。而水中含有豐富的營養元素及有機物，亦使其成為微生物生產和繁殖的重要場所[1]。微生物是河流生態環境中的主要初級生產者[2]。河流環境的變化會對河流微生物的種群分布造成影響，因此河流微生物的種群分布可以作為判斷河流生態環境是否遭到破壞的生物指標[3]。近年來分子生物學快速發展，低成本、自動化的高通量測序技術[4，5]，能同時對樣品中的優勢物種、稀有物種及一些未知的物種進行檢測，快速準確地獲得樣品中微生物群落的組成，在河流[6]和湖泊水庫[7]的微生物群落結構研究中得到廣泛應用。

嘉陵江為長江上游的主要支流，對嘉陵江的水體研究主要包括浮游生物多樣性[8，9]、有毒重金屬研究[10，11]和營養鹽濃度[12-14]，尚未見水體和底泥微生物群落的相關研究，尚不清楚嘉陵江水體的微生物群落組成與其環境因子的關系。本研究在嘉陵江下游合川段草街電站庫區范圍內開展。基于16S rRNA V4區域擴增子測序分析技術，在9月份對嘉陵江合川段進行采樣，分析水體和底泥微生物結構特征及其與環境因子的關系，以期為嘉陵江流域的環境監測和污染防治提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 研究區概況

嘉陵江位于東經103°45′～109°00′，北緯29°20′～34°25′之間，其左右岸支流(渠江和涪江)在合川城區匯入嘉陵江干流，而后在重慶朝天門匯入長江。

在利澤(LZ)、渠江口(QJ)、涪江口(FJK)、草街(CJ)設置4個采樣斷面，其中利澤斷面在渠江口上游，草街斷面在草街水庫大壩以上(圖1)。水體樣品以S.LZ、S.QJ、S.FJK、S.CJ表示，底泥樣品以N.LZ、N.QJ、N.FJK、N.CJ表示。

圖1 采樣點分布圖(1.利澤，2.渠江口，3.涪江口，4.草街)Fig.1 The location of the sampling sites

1.2 樣品采集

1.3 樣品DNA提取、PCR和16S rDNA測序

水樣和底泥樣品送至諾和致源公司(北京)，分離水樣和底泥基因組DNA用于16S rRNA基因的擴增和測序。細菌DNA提取按照CTAB方法進行。擴增區域為16S V4，擴增引物為515F-806R。酶和緩沖液：使用New England Biolabs 公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。反應程序：98 ℃預變性1 min；98 ℃10 s，50 ℃30 s，72 ℃30 s，30個循環；72 ℃ 5 min。PCR 反應體系和程序(30 μL)：Phusion Master Mix(2×)15 μL，Primer(2 μmd/L)3 μL(6 μmd/L)，gDNA(1 ng/μL)10 μL(5～10 ng)，H2O 2 μL。各樣品PCR擴增后，利用HiSeq進行上機測序。

1.4 測序數據分析

對原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據，然后基于有效數據進行OTUs(operational taxonomic units)聚類和物種分類分析，并將OTU和物種注釋結合，從而得到每個樣品的OTUs 和分類譜系的基本分析結果。再對OTUs 進行豐度、多樣性指數等分析，同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。最后在以上分析的基礎上，進行一系列的基于OTUs、物種組成的聚類分析，主成分分析(principal component analysis，PCA)、典型相關分析(canonical correlation analyses，CCA)等統計比較分析。

2 結果

2.1 微生物群落多樣性指數分析

利用諾和致源公司線上分析平臺分析4個采樣點水樣和底泥中的微生物多樣性指數，包括：觀察物種指數(obsevered species)、香農指數(Shannon index)、辛普森指數(Simpson index)和ACE指數等。水體中obsevered species指數介于678～989之間，底泥介于1 362～2 219之間。水體中香農指數介于3.27～6.89之間，辛普森指數介于0.68～0.97之間；底泥香農指數介于5.49～8.35之間，辛普森指數介于0.88～0.98之間，說明樣品的均勻度和多樣性較好。水體中Chao 1指數介于932～1 343之間，AEC指數介于1 012～1 399之間；底泥中Chao 1介于1 970～2 560之間，AEC指數介于1 895～2 637之間，表明樣品的豐度較大。

圖2為嘉陵江合川段水體和底泥中微生物豐度指數圖，由圖2可以看出：草街水體和底泥中微生物的多樣性較其他3個監測點均為最佳。

表1 微生物多樣性指數分析Tab.1 Analysis of microbial diversity index

圖2 水體和底泥中主要優勢菌門群落結構組成Fig.2 Composition of the main dominant microbial community structure in water and sediment

2.2 微生物群落組成

嘉陵江合川段水體中優勢微生物門類有：變形菌門(Proteobacteria，53.2%)、厚壁菌門(Firmicutes，23.1%)、放線菌門(Actinobacteria，11.8%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，4.9%)、藍細菌門(Cyanobacteria，9.6%)、浮霉菌門(Planctomycetes，1.9%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，1.1%)、酸桿菌門(Acidobacteria，1.0%)、綠菌門(Chlorobi，0.5%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，0.2%)。底泥中優勢微生物門類有：變形菌門(Proteobacteria，42.2%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，32.3%)、厚壁菌門(Firmicutes，8.0%)、放線菌門(Actinobacteria，4.3%)、酸桿菌門(Acidobacteria，3.4%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，2.3%)、綠菌門(Chlorobi，1.2%)、浮霉菌門(Planctomycetes，1.1%)、硝化螺旋菌門(Nitrospira，0.9%)、Ignavibacteriae(0.5%)。

2.3 微生物群落的空間分布

從嘉陵江合川段水體和底泥的微生物聚類樹狀圖(圖3)中可直接看出8個樣品之間微生物群落多樣性的相似性。嘉陵江合川段水體和底泥中的微生物群落結構組成均差異較大。4個水體樣品中均可聚為一類，說明各水體樣品中的微生物群落組成較為相似。而底泥中利澤與其他3個樣品的微生物群落表現出較大的差異，涪江口和渠江口聚類較近，微生物群落的結構較為相似。

圖3 微生物聚類樹狀圖Fig.3 Microbial clustering tree

圖4為微生物PCA分析，圖中的點代表各樣品，樣品間的相似度越高則在圖中越近，反之樣品間相似度越低則在空間距離越遠。由圖4也可以看出水體中的微生物相似度較高，而草街底泥中的微生物與其他樣品的微生物結構差異較大。

圖4 微生物PCA分析Fig.4 Microbial PCA analysis

2.4 物種豐度聚類熱圖分析

圖5為微生物在genus水平物種豐富熱度圖，在水體中的優勢微生物屬有：氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)，GKS98-freshwater-group屬，Chthoniobacter屬，鞘脂菌屬(Phingobium)，Prevotella-6屬，嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)，Masslilia屬，Psychobacter屬；而在底泥中有不動桿菌屬(Acinetobacter)，杜檊氏屬(Duganell)，Sporacetigenium屬，Psychrobacillus屬，Pseudarthrobacter屬，Paeniglutamicibacter屬，芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)，Ferruginibacter，Chthoniobacter屬，Fusibacter屬，Unidentified-Nitrosomonadaceae屬，Novosphinggobium屬。

圖5 微生物物種豐度聚類熱圖(a：水體，b：底泥)Fig.5 Abundance clustering heat map of microbial species

2.5 環境因子關聯分析

CCA分析用來分析環境因子對微生物結構的影響，實驗中監測的環境因子主要有：總磷(TP)、總氮(TN)、pH、懸浮物、高錳酸鹽指數、溶解氧、石油類和揮發酚含量。各環境因子數據見表2，對各環境因子進行CCA分析，結果表明，水體TP、TN及pH和水體中微生物結構顯著相關(P<0.05)，TP、TN及pH是影響水體中微生物結構的主要環境因子。而在這三個環境因子中，TP是影響草街水域微生物結構主要環境因子，TN是影響渠江口水域微生物結構的主要環境因子，pH是影響涪江口水域微生物結構的主要環境因子(圖6)。

表2 水體環境因子Tab.2 Environmental factor of water

圖6 環境因子分析Fig.7 Environmental factor analysis

3 討論

3.1 水體和底泥微生物多樣性差異

底泥樣品中平均香農指數大于水體樣品，表明水體和底泥中的微生物結構存在差異，底泥中微生物的種類更為豐富。可能是底泥環境復雜，滿足厭氧微生物類群的生存環境條件，一系列的生物化學反應在此發生，因此底泥中微生物物種多樣性更為豐富。

水體中的絕對優勢種群門類為：變形菌門、厚壁菌門、放線菌門，底泥中的絕對優勢種群為：變形菌門、擬桿菌門。水體中的特有優勢種群為：藍細菌門和芽單胞菌門，底泥中的特有優勢種群為硝化螺旋菌門和Ignavibacteriae。其中變形菌門、放線菌門和擬桿菌門在淡水富營養化水體中都是十分常見的[15]，說明嘉陵江合川段水域2017年秋季有富營養化趨勢。水體、底泥微生物群落特征及微生物指標評價研究[16]表明厚壁菌門是一類在廢水、廢棄物厭氧處理系統中起重要作用的微生物，在水體中出現較多的厚壁菌門，說明水體已面臨污染脅迫。藍細菌門在水體中占9.6%，提示水體有富營養化趨勢。相關研究表明，一種可裂解藍藻細胞的噬細胞菌(擬桿菌門細菌)的增多與水華的發生發展有緊密聯系[17]，因此擬桿菌門可能與富營養化存在某種潛在關系[15]。此外，擬桿菌是一類常見于人和動物體內且大量存在的致病菌，其下面多個菌屬可以分解高分子碳水化合物，例如多形擬桿菌具有分解多糖功能，底泥中擬桿菌比例相對較高，提示該區域受到人類活動較大影響。硝化螺旋菌門是一類硝化細菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，底泥中的硝化螺旋菌門占0.9%，說明底泥中細菌硝化作用較為活躍，水環境自凈能力較強。2012—2013年長江上游支流赤水河茅臺地區水體微生物優勢細菌類群為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門，秋季(10月)優勢細菌類群為變形菌門和擬桿菌門[18]，這與嘉陵江合川段水體中微生物優勢物種組成類似，由此推測長江上游水體中微生物優勢物種構成可能普遍相似。此外，茅臺地區赤水河的研究結果[18]表明，某個季節微生物的多樣性基本能反映地區全年的整體情況，因此對2017年秋季的嘉陵江合川段水域底泥微生物多樣性進行分析，基本能夠代表嘉陵江合川段全年微生物多樣性的情況。

3.2 各采樣點微生物組成分析

利澤和涪江口，渠江口和草街水體微生物物種多樣性組成相似，表明河流上下游水體微生物物種組成均一性較好，采樣位置差異對微生物物種多樣性的組成影響不大。而Gao等[19]研究污染河流時發現上下游微生物物種組成存在差異，譚旭等[18]也發現茅臺地區赤水河上游較下游微生物群落多樣性有微弱的優勢，這都與該研究結果不同，可能的原因是嘉陵江合川段處在草街水電站庫區范圍內，水生態環境較為均一，與自然河道有較大差異，且沒有對微生物結構造成顯著影響的持續污染源，因此河流上下游水體的微生物物種組成相似。而茅臺地區赤水河流速大，水生態環境多樣，下游生產生活對河水物質組成產生很大影響，因此上下游微生物組成表現出差異。但是，實驗中各采樣點微生物豐度的不同主要是人類活動的影響。下游草街采樣點距草街電站距離較近，水文條件長期穩定，適宜微生物的繁殖，水體中各種微生物豐度均較大。茅臺地區赤水河下游微生物豐度比上游樣品高[18]，這與張旭[16]的研究結果相一致，說明河流微生物結構組成與水文環境和人類活動影響方式的不同密切相關。草街水域豐度較大的微生物為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門。其中放線菌可以吸收營養物質，對水體有凈化作用[20]，疣微菌門則是富營養化水體中常見的細菌[21]。最上游采樣點利澤微生物豐度也較大，主要為變形菌門和厚壁菌門。渠江口能分解有機物的[22]氫噬胞菌屬豐度最大，涪江口處在合川城區，生活、生產及運輸帶入大量有機物，因此涪江口氫噬胞菌有機物分解作用較其他三個采樣點更為活躍。

涪江口和渠江口底泥中微生物物種多樣性組成相似，這兩處采樣點是嘉陵江與其支流涪江與渠江的匯合處，都分布在城區范圍內。張旭[16]的研究結果表明，城區和郊區底泥表現出不同的微生物多樣性，底泥微生物群落結構與區域相關，這也與本次研究結果相一致。從微生物豐度上看，豐度較大的微生物主要為不動桿菌屬和杜檊氏屬，杜檊氏屬能夠降解水體中的有機物，起到凈化水體的作用[23]，這也與涪江口和渠江口地處城區有關。此外，我們還發現上游和下游的利澤和草街底泥中豐度較大的微生物較多，可能的原因是城區較為密集的人類活動導致某些微生物生長繁殖受到影響。

3.3 環境對微生物結構的影響

Wang等[24]表明，生態系統中微生物結構是非隨機空間分布的，但影響微生物組成的主要環境因子并不固定。本研究中，總磷、總氮和pH對水體中微生物群落結構的變化有較大的影響。Sterner等[25]研究表明，細菌生長受到生物體和基質中N/P、C/N和C/P組成的影響。基質中元素比變化會引起細菌進行酶活性、基因表達和生理反應的調節，最終影響物種之間競爭和占位，并引起優勢物種和生物多樣性的改變[26]。

黃藝等[27]認為浮游細菌生物完整性指數(BP-IBI)可用于滇池流域生態健康的評價。張旭[16]以寧波境內河流為例建立了微生物生物性完整性指標，評價河流水體生態健康狀況。微生物群落多樣性是水環境敏感性生物指標之一，隨著水環境的變化，具有不同的結構特征，水生態環境與微生物結構具有相關性，通過微生物群落結構變化能夠預測環境質量的變化。開展嘉陵江乃至長江流域微生物結構研究，建立微生物指標評價，對水環境保護和水體及底泥污染的生物治理具有參考意義。