辛伐他汀對2型糖尿病認知功能障礙的保護作用及其機制研究

張禾偉，房輝，孫雪玲，張雅中，田金莉

本文意義：

本文通過行為學檢測及組織學觀察，確定2型糖尿病大鼠認知功能障礙的存在，應用Western blotting證實雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/p70核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）信號通路的激活和氧化應激相關蛋白的增多，并通過給予辛伐他汀改善2型糖尿病大鼠認知功能，抑制mTOR/p70S6K信號通路和氧化應激相關蛋白表達，為2型糖尿病認知損傷發生機制的研究提供新思路，為辛伐他汀在2型糖尿病患者中樞神經系統并發癥中的臨床應用提供理論依據。

糖尿病是目前患病率較高的慢性代謝性疾病之一。根據國際糖尿病聯盟（IDF）統計，預計到2030年，中國糖尿病人群將增加至1.3億［1］，其中大部分為2型糖尿病（T2DM）患者。T2DM除了可導致周圍神經病變外，目前有研究表明T2DM可能對中樞神經系統（CNS）功能產生不利影響，其中認知功能障礙是最常見的癥狀［2］。MIJNHOUT等［3］提出了“糖尿病相關認知衰退（DACD）”一個新的術語，但糖尿病認知功能障礙的發病機制目前尚未十分明確，改善DACD的藥物也亟待深入研究。有研究表明，辛伐他汀具有改善阿爾茨海默病（AD）患者認知功能的作用，潛在作用機制涉及多個方面［4-6］。認知功能障礙包括學習記憶能力、注意力、執行力下降，處理速度減慢和語言流暢度下降［7］。目前關于辛伐他汀對T2DM患者認知功能的作用及潛在機制的研究尚不多見，本實驗通過觀察辛伐他汀對T2DM大鼠學習記憶能力的影響，探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/p70核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）信號通路在辛伐他汀改善認知功能中的作用，旨在為臨床T2DM認知功能障礙的診斷和治療尋找新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠120只，8周齡，體質量（260±10）g，購自北京維通利華實驗動物公司〔許可證號：SYXK（京）2017-0022〕，溫度21～26 ℃，相對濕度40%～70%，飼養2周適應環境后用于實驗。本研究經唐山市工人醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗藥品與試劑 鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司，辛伐他汀片（40 mg/片）購自美國默沙東公司，兔抗大鼠mTOR多克隆抗體（ab2732）、兔抗大鼠p70S6K多克隆抗體（ab32529）、兔抗大鼠tau多克隆抗體（ab32057）、兔抗大鼠丙二醛（MDA）多克隆抗體（ab194225）、兔抗大鼠谷胱甘肽（GSH）多克隆抗體（ab19534）、兔抗大鼠p-mTOR多克隆抗體（ab177734）、兔抗大鼠p-p70S6K單克隆抗體（ab59208）、兔抗大鼠p-tau多克隆抗體（ab109390）均購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（ZB-2306）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，增強化學發光試劑（ECL）（PP2403）購自北京艾德萊生物科技有限公司，蘇木素、伊紅染液、Western轉膜液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠配制試劑盒和SDS-PAGE電泳液均購自碧云天生物技術研究所。

1.3 儀器與設備 Morris水迷宮（上海欣軟科技有限公司），FluorChen 5500凝膠成像分析系統（美國Thermo公司），BX-60型顯微鏡（日本Olympus公司），顯微照相機（日本Olympus公司），Leica1512型石蠟切片機（德國Leitz公司），病理組織包埋機（德國LEICA公司），病理組織包埋冷凍臺（德國LEICA公司），電泳轉移槽（北京六一儀器廠），S-1000脫色搖床（其林貝爾儀器制造有限公司），SZ-93型自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠），AL204電子分析天平〔梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司〕，TGL-16G-A型低溫離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 模型制備 于2016年9月采用隨機數字表法將120只健康雄性SD大鼠分為對照組（40只）、糖尿病組（40只）和辛伐他汀組（40只），各組自由進食水，糖尿病組和辛伐他汀組制備T2DM大鼠模型，高脂飼料飼養8周后，將STZ（40 mg/kg）溶解于0.1 mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液中，腹腔注射。72 h后，抽取鼠尾靜脈血，采用羅氏血糖儀測定血糖。T2DM大鼠模型評價標準：血糖≥16.7 mmol/L為T2DM大鼠模型造模成功。對照組腹腔注射等體積枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。糖尿病組、辛伐他汀組分別造模成功38、37只，造模成功后各組大鼠標準飼料飼養14周。

1.4.2 干預方法 造模成功后，將辛伐他汀溶于2 ml 0.9%氯化鈉溶液，辛伐他汀組大鼠采用辛伐他汀灌胃（20 mg·kg-1·d-1），對照組和糖尿病組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。干預后各組大鼠標準飼料飼養14周。

1.4.3 Morris水迷宮實驗 大鼠進行Morris水迷宮實驗，檢測其空間學習和記憶能力。在直徑為1.2 m的水池的南西（SW）象限內設置一個平臺，作為目標象限，直徑為10 cm，位于水面下1 cm。實驗室的物品和人員位置在實驗期間固定不變，作為空間參照物。第1天進行定位航行實驗（place navigation），大鼠第1、4次從目標象限對側的北東（NE）象限面朝池壁入水，第2、3次采用隨機數表法選擇象限（遇奇數時入東南象限，遇偶數時入西北象限）面朝池壁入水，測試4次/d，休息時間為10 min/次，監測時間為100 s，持續4 d，記錄大鼠從入水到登島成功的時間，即逃避潛伏期，大鼠在平臺上停留＞2 s判為登島成功，若大鼠100 s內未成功則記為100 s。訓練后，用干毛巾將大鼠擦干，以防止低體溫造成的應激。第5天進行空間搜索實驗，拆除平臺，大鼠在NE象限面朝池壁下水，觀察并記錄120 s內大鼠在SW象限內的停留時間，評估大鼠的記憶能力，停留時間越長，表示記憶能力越強。

1.4.4 超微病理檢測 大鼠進行Morris水迷宮實驗后，采用電子分析天平稱量大鼠體質量，通過腹腔注射10%水合氯醛（4 ml/kg）深度麻醉大鼠（角膜反射消失），沿胸骨旁線剪開胸腹腔，充分暴露心臟、肝臟及主動脈，針頭經左心室穿刺入升主動脈，剪開右心耳，以0.9%氯化鈉溶液快速心臟灌注，至右心耳流出清亮液體，肝臟變白后，采用約250 ml的4%多聚甲醛溶液（pH為7.4）灌注至肢體僵硬，灌注速度先快后慢。待肢體充分固定后取兩側海馬組織，一側海馬組織放入液氮速凍，-80 ℃保存；另一側海馬組織放入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h，將海馬組織脫水，石蠟包埋，以2 μm連續切片，常規烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素、伊紅染色，常規梯度乙醇脫水，中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察各組大鼠海馬結構的改變。

1.4.5 Western blotting 取出備用的海馬組織，用預冷的眼科剪剪碎組織，冰浴中用勻漿器將組織勻漿，加入裂解液（每20 mg組織加入120 μl裂解液），4 ℃低溫離心機，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液，按每泳道50 μg總蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，電泳轉移槽調為穩壓狀態，電壓為80 V，使樣品通過濃縮膠；當溴酚藍入分離膠后，將電壓調至120 V，繼續電泳，至溴酚藍達分離膠底部結束電泳。分離后轉膜，浸入封閉液，室溫孵育1.5 h。分別加入兔抗大鼠mTOR多克隆抗體（ab2732）（1∶1 000）、兔抗大鼠p70S6K多克隆抗體（ab32529）（1∶1 000）、兔抗大鼠tau多克隆抗體（ab32057）（1∶1 000）、兔抗大鼠MDA多克隆抗體（ab194225）（1∶1 000）、兔抗大鼠GSH多克隆抗體（ab19534）（1∶1 000）、兔抗大鼠p-mTOR多克隆抗體（ab177734）（1∶1 000）、兔抗大鼠p-p70S6K單克隆抗體（ab59208）（1∶1 000）、兔抗大鼠p-tau多克隆抗體（ab109390）（1∶1 000），4 ℃反應過夜，再加入HRP標記二抗（ZB-2306）工作液，室溫避光緩慢搖90 min，ECL顯色，曝光成像，重復3次。將實驗結果用掃描儀進行掃描，在同一條件下，以β-actin為內參基因，采用ImageJ 1.41醫學圖像分析系統測定條帶平均光密度（OD）值，進行比較。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以（±s）表示，多組間不同時間比較采用重復測量方差分析，同組不同時間及多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 3組大鼠空腹血糖、體質量比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；其中，糖尿病組和辛伐他汀組大鼠空腹血糖高于對照組，體質量低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01，見表1）。對照組大鼠的精神狀態較好，呼吸節律平穩，毛色發亮，反應靈敏，動作靈活，攝食攝水正常；糖尿病組大鼠精神萎靡，行動遲緩、嗜睡，皮毛枯黃無光澤，少數被毛脫落，飲水量增加，偶有大便干結；辛伐他汀組大鼠較糖尿病組，精神良好，體能恢復，皮毛少有枯黃，飲水量減少。

2.2 Morris水迷宮實驗結果 對照組不同時間的逃避潛伏期比較，差異有統計學意義（F=2 487.91，P＜0.01），其中，對照組第1天的逃避潛伏期長于第2、3、4、5天，第2天的逃避潛伏期長于第3、4、5天，第3天的逃避潛伏期長于第4、5天，第4天的逃避潛伏期長于第5天，差異均有統計學意義（P＜0.05）。處理方法與時間對逃避潛伏期存在交互作用（P＜0.01）；干預方法、時間對逃避潛伏期的影響，主效果均顯著（P＜0.01）。其中，糖尿病組和辛伐他汀組第2、3、4、5天的逃避潛伏期長于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；辛伐他汀組第2、3、4、5天的逃避潛伏期短于糖尿病組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 海馬組織病理觀察結果 顯微鏡觀察顯示，對照組海馬神經元細胞結構完整，形態正常，無明顯病理學改變，細胞膜結構完整、胞核完整、胞質豐富；糖尿病組海馬神經元細胞形態不規則，排列紊亂、數量顯著減少，細胞膜失去原有完整結構，核固縮，核仁部分消失；辛伐他汀組海馬神經元細胞結構大致正常，數量略減少，少數細胞膜失去完整結構，胞核完整（見圖1）。

2.4 mTOR/p70S6K信號通路蛋白表達水平 3組的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；其中，糖尿病組和辛伐他汀組的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；辛伐他汀組的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau低于糖尿病組，差異均有統計學意義（P＜0.01，見表3、圖2）。

2.5 氧化應激相關蛋白表達水平 3組的MDA/β-actin、GSH/β-actin比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；其中，糖尿病組和辛伐他汀組的MDA/β-actin、GSH/β-actin高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；辛伐他汀組的MDA/β-actin、GSH/β-actin低于糖尿病組，差異均有統計學意義（P＜0.01，見表4、圖3）。

3 討論

糖尿病是世界上最常見的代謝性疾病之一，由于其患病率日益增加，已經成為全球嚴重的公共衛生問題［8］。據估計，截至2035年，全球219個國家的糖尿病患者將達到381.8萬人［9］。越來越多的證據表明T2DM與認知功能障礙和癡呆相關［10-11］。許多流行病學研究已經證明，T2DM患者發展為AD的風險明顯增高［12-13］。T2DM與AD的發生密切相關，胰島素信號傳導障礙、糖基化終末產物（AGEs）的增加以及氧化應激水平的增強與AD的發生發展相關［14］。另外，以MDA和GSH為代表的氧化應激相關蛋白，也與糖尿病所致認知功能障礙有關［15］。高血糖能夠通過多條途徑影響認知功能，如mTOR/p70S6K信號通路、Akt/GSK3β信號通路和胰島素降解途徑，從而影響研究對象認知功能［16-17］。目前臨床上還沒有針對T2DM認知功能障礙的藥物。他汀類藥物作為經典的降低膽固醇、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的藥物，已被證實具有中樞神經系統保護作用［18］。其中辛伐他汀更是具有抗炎、免疫調節和改善認知功能等多重獲益［19］，不僅能夠通過激活相關通路，抑制海馬細胞凋亡［20］，而且能夠改善細胞氧化應激水平［21］，增強空間定位和學習記憶能力。這種神經保護作用已經在多種動物模型中得到證實［22-23］，而辛伐他汀在T2DM認知功能障礙中的作用及潛在機制尚未被深入研究。

表1 3組大鼠空腹血糖和體質量比較（±s）Table 1 Comparison of fasting blood glucose and body mass among the three groups of rats

表1 3組大鼠空腹血糖和體質量比較（±s）Table 1 Comparison of fasting blood glucose and body mass among the three groups of rats

注：與對照組比較，aP＜0.01

組別 只數 空腹血糖（mmol/L） 體質量（g）對照組 40 6.0±0.6 521±15糖尿病組 38 17.3±2.3a 438±13a辛伐他汀組 37 17.2±2.3a 441±17a F值 460.905 381.845 P 值 ＜0.01 ＜0.01

表2 3組大鼠逃避潛伏期比較（±s，s）Table 2 Comparison of the escape latency among the three groups of rats

注：與對照組相比，aP＜0.01；與糖尿病組相比，bP＜0.01

組別 只數 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天對照組 40 97.3±1.8 80.5±3.2 74.3±1.8 67.7±0.9 53.3±1.9糖尿病組 38 97.2±1.8 92.5±3.0a 84.4±3.2a 78.6±4.2a 69.6±1.0a辛伐他汀組 37 97.3±0.9 85.4±4.1ab 77.3±1.9ab 74.4±3.2ab 60.2±2.2ab F 值 F交互=148.62，F組間=196.38，F時間=10 359.79 P 值 P交互＜0.01，P組間＜0.01，P時間＜0.01

表3 3組大鼠mTOR/p70S6K信號通路蛋白表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of mTOR/p70S6K pathway protein expression levels among the three groups of rats

表3 3組大鼠mTOR/p70S6K信號通路蛋白表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of mTOR/p70S6K pathway protein expression levels among the three groups of rats

注：mTOR=雷帕霉素靶蛋白，p70S6K=p70核糖體蛋白S6激酶；與對照組比較，aP＜0.01；與糖尿病組比較，bP＜0.01

組別 只數 p-mTOR/mTOR p-p70S6K/p70S6K p-tau/t-tau對照組 40 0.51±0.10 0.48±0.10 0.55±0.02糖尿病組 38 0.81±0.06a 0.81±0.08a 0.79±0.08a辛伐他汀組 37 0.69±0.07ab 0.68±0.08ab 0.78±0.09ab F值 336.789 262.511 248.456 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 3組大鼠海馬組織超微病理檢測結果（HE染色，×400）Figure 1 Ultrastructural pathological test results of the hippocampus among the three groups of rats

圖2 3組大鼠mTOR/p70S6K信號通路蛋白的表達Figure 2 Expression of protein in the mTOR/p70S6K pathway among the three groups of rats

表4 3組大鼠氧化應激相關蛋白表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of oxidative stress-related protein expression levels among the three groups of rats

表4 3組大鼠氧化應激相關蛋白表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of oxidative stress-related protein expression levels among the three groups of rats

注：MDA=丙二醛，GSH=谷胱甘肽；與對照組比較，aP＜0.01；與糖尿病組比較，bP＜0.01

組別 只數 MDA/β-actin GSH/β-actin對照組 40 0.45±0.04 0.49±0.12糖尿病組 38 0.80±0.05a 0.82±0.08a辛伐他汀組 37 0.65±0.06ab 0.68±0.07ab F值 458.872 285.590 P值 ＜0.01 ＜0.01

圖3 3組大鼠氧化應激相關蛋白表達Figure 3 Expression of oxidative stress-related protein among the three groups of rats

本研究Morris水迷宮實驗結果顯示，隨訓練日數增加，糖尿病組大鼠逃避潛伏期顯著長于對照組，表明糖尿病大鼠存在空間學習能力的缺陷。顯微鏡觀察顯示，糖尿病組大鼠海馬組織神經元丟失和結構損害；辛伐他汀干預后顯著縮短大鼠逃避潛伏期，海馬神經元結構和完整性也有所改善。與對照組相比，糖尿病組大鼠海馬組織mTOR、p70S6K和tau磷酸化水平明顯增加，說明高糖刺激mTOR/p70S6K信號通路激活后，tau磷酸化水平增加。氧化應激產物MDA和GSH的表達水平隨之升高。辛伐他汀干預后mTOR、p70S6K和tau磷酸化水平得到抑制，MDA和GSH的表達水平也隨之降低。表明辛伐他汀能夠抑制mTOR/p70S6K信號通路，同時發揮抗氧化作用。

mTOR/p70S6K信號通路是近年來分子生物學和細胞生物學的研究熱點之一，p70S6K是mTOR下游的主要靶點之一，其磷酸化水平是評估mTOR活性的重要指標［24］。mTOR/p70S6K信號通路參與葡萄糖代謝和記憶形成，過度激活的mTOR / p70S6K信號通路被認為與認知功能障礙有關［25-26］。關于人體SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞、小鼠神經母細胞瘤細胞和原代皮質神經元等的多項研究中均發現，mTOR/p70S6K信號通路在tau過度磷酸化中有重要作用，mTOR和p70S6K的異常上調與AD腦組織中過度磷酸化tau的積累有關［27-28］。抑制mTOR與p70S6K表達能夠改善學習和記憶，并減少轉基因AD小鼠模型的tau磷酸化［29］。GAO等［30］研究證實辛伐他汀具有激活mTOR/p70S6K信號通路改善認知功能的作用。與此同時，研究顯示Akt/mTOR/S6K信號通路的激活能夠提高GSH表達水平［31］。本研究證明辛伐他汀抑制氧化應激產物的表達，發揮抗氧化作用，但具體是否通過激活mTOR/p70S6K信號通路發揮作用，有待進一步研究。

綜上所述，T2MD認知功能障礙大鼠中，存在mTOR/p70S6K信號通路的激活和tau過度磷酸化和氧化應激水平的改變，辛伐他汀能夠抑制mTOR/p70S6K信號通路的激活和tau的磷酸化程度，具有抗氧化作用，改善T2DM大鼠認知功能。今后的研究可以進一步在基因和細胞水平研究辛伐他汀通過mTOR/p70S6K信號通路在糖尿病腦病中的作用機制，為尋找治療靶點提供理論依據。

作者貢獻：張禾偉、房輝進行文章的構思與設計，撰寫與修訂論文，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理；孫雪玲進行研究的實施與可行性分析；張禾偉、張雅中進行數據收集；孫雪玲、田金莉進行數據整理；張禾偉、田金莉進行統計學處理，結果的分析與解釋。

本文無利益沖突。