血清ANCA檢測在系統性紅斑狼瘡疾病中的應用

董曉微,崔學強,張俊華,樸文花,2

(1.寧夏回族自治區人民醫院 (西北民族大學教學合作醫院) 臨床醫學檢驗診斷中心,寧夏 銀川750002;2.西北民族大學第一臨床學院,寧夏 銀川750002)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)臨床癥狀較為復雜，通常以多系統侵害為主要表現，尤其是腎臟、皮膚血管炎損傷較為嚴重，其發病原因較為復雜。近幾年，全世界對SLE患者的檢測方法較為重視，抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)的發現為SLE的檢測有推動性影響。ANCA是一種免疫球蛋白，在系統性血管炎患者中具有較高的陽性檢出率，如類風濕關節炎、潰瘍性結腸炎等，在自身免疫性疾病中較為多見。有研究稱，SLE患者ANCA檢測陽性檢出率較高，且能夠監測SLE疾病活動性[1,2]。既往臨床上以間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)作為檢測ANCA的“金標準”，具有簡便、廉價等優勢[3]。但IIF具有一定局限性，例如無法做定量分析，而酶聯免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)能夠彌補IIF的不足，考慮可能適用于SLE患者ANCA的檢測，本文對此展開研究，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇62例2015年9月-2017年9月在醫院接受治療的SLE患者，所有入選者均有完整的IIF檢測ANCA資料，并對陽性ANCA患者進行ELISA檢測，患者年齡43-75歲(均62.17±3.08)歲，男8例，女54例；另選擇同期經ELISA檢測ANCA的正常人群51例，年齡29-78歲(均58.74±4.15)歲，男8例，女43例，兩種群體人口學資料差異不顯著(P>0.05)。納入標準[4]：(1)均達到美國風濕病學會于1997年修訂的SLE診斷標準[5]；(2)患方對檢測項目知情，簽訂知情同意書；(3)患者均為成年人；(4)患者在檢測過程中依從性良好。排除標準：(1)有嚴重代謝類疾病、重大臟器受損者；(2)合并精神障礙者；(3)資料不全者。

1.2方法抽取入選者4 ml靜脈血，放置于無菌的真空生化試管內，由專人以3 000 r/min離心10 min，獲得全部入選者的血清樣本。ANCA檢測首先以IIF進行，用PBS緩沖液稀釋患者血清，濃度比為10∶1，依據試劑盒上的操作說明，規范操作，分出陰性、陽性、空白對照結果。再將IIF檢測結果為ANCA陽性的入選者進行ELISA蛋白水解酶3(Proteolytic enzyme 3，PR3)、抗髓過氧化物酶(Myeloperoxidase resistance，MPO)檢測，并通過PR3、MPO含量判斷ANCA陽性情況。

1.3評價指標比較健康入選者、其他疾病患者和SLE患者陽性ANCA檢出率的不同，并統計ANCA陽性患者和陰性患者SLE活動指數(systemic lupus erythematosus diseaseactivity index，SLEDAI)方面的差異。本研究SLEDAI觀察指標包括貧血、補體、腎功能、dsDNA抗體、皮膚血管炎、發熱、肺間質變、關節腫痛、血沉。對SLE患者活動指標情況進行判讀，SLEDAI積分低于10分為非活動性，超過10分為活動性[6]。

2 結果

2.1SLE患者、健康人群ANCA陽性檢出率的比較SLE患者和健康人群ANCA陽性檢出率有顯著差異(P<0.05)，見表1。

2.2SLE患者ANCA檢測和SLE活動性指標的關系SLE患者補體C3或C4下降、肺間質變、皮膚血管炎、腎功能受損、dsDNA抗體陽性方面ANCA陽性顯著高于ANCA陰性(P<0.05)，而貧血、血沉>20 mm/h、發熱、關節腫痛ANCA陽性和ANCA陰性間差異不顯著(P>0.05)，見表2。

表1 SLE患者、健康人群陽性ANCA檢出率的比較

表2 SLE患者ANCA檢測與SLE活動性指標的關系

2.3SLE患者ANCA陽性與SLEDAI的比較對ANCA陽性SLE患者進行SLEDAI積分評價，≥10的占比為73.91%，ANCA陰性SLEDAI積分≥10占比為58.97%，有顯著差異(P<0.05)，差異顯著(P<0.05)，見表3。

表3 SLE患者ANCA陽性與SLEDAI的比較

3 討論

SLE為一類典型的自身免疫性疾病，其病理學機制可能是受到可溶性抗原—抗體免疫復合物在血管壁上積聚，或者是自身抗體受到免疫介導，高度活化了機體內的B淋巴細胞、T淋巴細胞等，形成免疫復合物，使病變延伸到機體多個臟器或組織，誘發多系統的免疫學異常，形成大量具有高親和力的自身抗體，針對健康細胞不同成分進行抑制，誘發本病[7-9]。如果本病患者得不到及時、有效的診斷和治療，病情會長時間惡化，預后較差。

ANCA主要存在于單核細胞胞漿或中性粒細胞內，是一種與胞漿中溶酶體酶發生反應的抗原抗體，于1990年在系統性血管炎中被發現，而隨著臨床研究進展，ANCA逐漸被發現于SLE患者血清中，作為血清學標記性抗體之一，但關于ANCA與SLE的具體診斷意義卻一直缺乏系統評價[10]。同時，臨床上診斷ANCA的方法也多種多樣，比如免疫沉淀法、IIF、ELISA、放射免疫法等，其中以IIF檢測ANCA的臨床應用時間較長，是一種較為經典的ANCA檢測方法，同時也作為ANCA檢測的“金標準”，但其單獨使用的缺點是由于受到乙醇固定過程中有核糖體P蛋白、線粒體等物質，易造成自身抗體和其結合，形成強弱不等的熒光，對ANCA結果造成影響[11-13]。IIF盡管能測定總ANCA情況，但難以區分靶抗原，需要添加特異性檢測。ELISA因為具有能夠定量測量PR3、MPO。PR3、MPO均為ANCA的主要抗原。PR3是一類絲氨酸蛋白酶，存在于中性粒細胞胞漿嗜天青顆粒內，具有促進血小板活化，降解外基質如彈性蛋白、IV型膠原的能力，是診斷血管炎的重要指標之一。MPO是一類血紅素蛋白酶，主要存在于髓系細胞嗜苯胺藍顆粒之中，屬血紅素過氧化物酶的一種，為髓細胞特異性標志[14]。二者與SLE疾病活動度有顯著相關性，因此ELISA在ANCA的測量中具有良好效果。但出于最優化選擇、成本方面的計劃，先進行IIF，再進行ELISA為目前為止ANCA檢測的最佳方式[15]。

本研究通過分析ELISA結合IIF對健康人群和SLE患者ANCA陽性檢出率的比較，發現SLE患者陽性檢出率明顯高于健康人群，提示ANCA具有可能診斷SLE疾病的意義，但關于ANCA對SLE的影響機制尚不明確。通過觀察ANCA陰性、ANCA陽性患者臨床癥狀和實驗室指標等活動性指標方面的差異，發現ANCA陰性和ANCA陽性患者在血沉>20 mm/h、貧血、關節腫痛、發熱方面沒有顯著差異，而在腎功能受損、皮膚血管炎、肺間質變、補體C3或C4下降、dsDNA抗體陽性方面差異顯著，ANCA陽性患者SLEDAI≥10的占比明顯高于ANCA陽性患者，提示SLEDAI、活動性指標和ANCA陽性檢出情況之間有一定關系。這考慮是ANCA陽性在SLE患者狼瘡病情活動期會產生毛細血管擴張、血管病變加劇等特點，形成皮膚血管炎，或者部分患者伴有肺間質變、腎小球腎炎等病情，累及患者肺、腎等器官組織，加重病情。ANCA陽性在dsDNA抗體陽性方面有顯著差異，考慮是dsDNA抗體是一種具有雙鏈DNA結構的抗體，能夠和DNA結合，形成免疫復合物，沉積于腎小球基底膜，是SLE活動期的重要指標[16]。C3、C4均為補體系統中較為重要的組成部分，具有激活主要途徑的生物學功能，補體C3或C4下降能夠說明SLE病情的發生及發展，在本研究中，補體C3或C4下降提示SLE處于活動期。而ANCA陽性對貧血、關節腫痛、血沉>20 mm/h、發熱等癥狀沒有顯著影響，考慮ANCA陽性在這些方面敏感性不高，或者受到樣本數量限制的影響，產生一定偏差。總之，ELISA檢測所得的ANCA陽性率可能從一定程度上可以反映SLE病情的嚴重程度、疾病活動度。

綜上所述，對于SLE患者，在常規IIF檢測ANCA的基礎上，增加ELISA檢測，所測得的ANCA陽性準確率較高，ANCA陽性能夠從一定程度上反映SLEDAI、SLE疾病活動性，ANCA陽性與SLE疾病診斷之間有一定關聯。