DNA疫苗對APP/PS1轉基因鼠免疫反應類型及腦內炎癥反應的影響

陳 新,吳慧穎,邢曉娜

(1.遼寧省人民醫院;2.吉林大學第二醫院;3.中國醫科大學人民醫院，遼寧 沈陽110015)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的病因及發病機制迄今尚不明確，已有證據表明β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)在AD的發病中起著至關重要的起始及樞紐作用[1]，是各種原因誘發AD的共同通路。Aβ是老年斑的主要組成成分，Aβ聚集在導致老年斑形成、突觸減少、神經功能失調、神經元死亡以及有臨床癥狀的癡呆方面起關鍵作用[2]。本研究構建了DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4，編碼重復10次的Aβ3-10并且融入小鼠白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)作為基因佐劑，探討其免疫AD轉基因鼠(APP/PS1)免疫反應類型、腦內老年斑及炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑8月齡APP/PS1轉基因小鼠15只，購自中國醫科大學實驗動物部。質粒大量提取試劑盒(OMEGA)；抗Aβ抗體6E10(Signet)；Aβ42肽(AnaSpec)；即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德)；ECM830電穿孔儀(美國BTX)。

1.2p(Aβ3-10)10-mIL-4合成及提取[3]人工合成重復10次的Aβ3-10的基因片段，裝載到puc57載體。雙酶切(Aβ3-10)10基因片段和模板質粒pcDNA3.1(+)-mIL4。將(Aβ3-10)10基因片段克隆入pcDNA3.1(+)-mIL4質粒，合成重組質粒p(Aβ3-10)10-mIL-4。測序正確后用質粒大量提取試劑盒進行大量提取。

1.3動物免疫15只8月齡雌性APP/PS1轉基因鼠隨機分成3組，每組5只。p(Aβ3-10)10-mIL-4組(觀察組)：每只鼠免疫p(Aβ3-10)10-mIL-4，100 μg/次。pcDNA3.1(+)組(陰性對照組)：每只鼠免疫pcDNA3.1(+)，100 μg/次。兩組小鼠注射質粒前腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后在左后肢股四頭肌肌肉注射質粒100 μg，之后用ECM830電穿孔儀進行電穿孔[4]；Aβ42組(陽性對照組)：每只鼠免疫Aβ42肽50 μg/次，左后肢股四頭肌肌肉注射。第1次免疫后每2周免疫一次，第3次免疫后每1個月免疫一次，共免疫9次。

1.4脾細胞培養上清的細胞因子檢測

1.4.1脾細胞培養 最后一次免疫2周后，每組選取2只小鼠。斷頸處死小鼠，將小鼠脾臟置于100 μm孔徑的尼龍網篩上，用鑷子將脾搗碎并用注射器內柱輕輕研磨組織塊。將所得溶液離心。將所得沉淀重懸于5 ml紅細胞裂解液(ACK溶液)中，再次離心。將沉淀重懸于5 ml PBS中，離心。將懸液加入96孔培養板中每份懸液加8個孔，每孔加100 μl細胞懸液。分別在每一份懸液8個孔中的前2孔加入RPMI 1640培養液，100μl/孔；接著2個孔加入重組質粒p(Aβ3-10)10-mIL-4真核表達蛋白產物[4]，100 μl/孔(10 μg/ml)；接著2個孔加入Aβ42，100μl/孔(10μg/ml)；最后2個孔加入ConA(伴刀豆凝集素A)，100 μl/孔(2 μg/100 μl)。于37℃、5%CO2、90%濕度培養箱內連續培養72 h。將刺激物各孔上清小心吸出，-70℃凍存。

1.4.2細胞因子檢測 ELISA試劑盒檢測細胞因子IL-4及γ干擾素(IFN-γ)。步驟按試劑盒說明書進行。(1)IL-4測定：將標準品依次稀釋為240 pg/ml，120 pg/ml，60 pg/ml，30 pg/ml，15 pg/ml。在酶標包被板上加樣。封板后置37℃溫育30 min。洗滌5次。每孔加入酶標試劑50 μl，空白孔除外。封板后置37℃溫育30 min。洗滌5次。每孔先后加入顯色劑A、B各 50 μl， 37℃避光顯色15 min。終止反應。450 nm波長測量各孔的吸光度(OD值)。

(2)IFN-γ測定：標準品的稀釋：將標準品依次稀釋為800 pg/ml，400 pg/ml，200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml。其余步驟同IL-4測定步驟。

1.5免疫熒光檢測老年斑及小膠質細胞APP/PSl轉基因小鼠腦組織石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫二甲苯，PBS沖洗，微波煮沸抗原修復，自然冷卻，PBS沖洗。經正常驢血清(normal donkey serum，NDS)(1∶20)室溫預孵育1 h后，小鼠抗Aβ抗體6E10 (1∶1000)和兔Iba1抗體(1∶500)混合液室溫孵育過夜，漂洗，FITC和TexasRed標記的熒光二抗混合液室溫2 h孵育，漂洗，熒光封片劑封片，共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察并采集圖像和分析。

2 結果

2.1重組質粒p(Aβ3-10)10-mIL-4的構建目的基因(Aβ3-10)10片段成功合成并克隆入pcDNA3.1(+)-mIL-4質粒中。經酶切及測序證實質粒構建正確。

2.2ELISA方法檢測脾細胞培養上清中的細胞因子水平在相應抗原刺激后的脾細胞培養上清中，Aβ42組(108.19±11.24 pg/ml)及p(Aβ3-10)10-mIL-4組(102.73±14.83 pg/ml)的IL-4的含量均明顯高于pcDNA3.1(+)組(28.67±5.14 pg/ml)(P<0.01)，但是兩組比較無顯著差異(P>0.05，圖1A)。Aβ42組的IFN-γ的含量(263.34±29.3 pg/ml)明顯高于p(Aβ3-10)10-mIL-4組(96.8±8.35 pg/ml)(P<0.01)及pcDNA3.1(+)組(80.66±12.45 pg/ml)(P<0.01)。而p(Aβ3-10)10-mIL-4組和pcDNA3.1(+)組的IFN-γ含量沒有顯著差別(P>0.05，圖1B)。

2.3DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫對APP/PS1轉基因鼠腦內老年斑及小膠質細胞的影響免疫熒光結果顯示，pcDNA3.1(+)組APP/PS1轉基因鼠腦內可見很多Iba1陽性細胞，尤其圍繞在老年斑周圍。Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組腦組織中的Iba1陽性細胞及老年斑與pcDNA3.1(+)組相比明顯減少(圖2)。

注：圖1 A：脾細胞培養上清中細胞因子IL-4含量。**與pcDNA3.1(+)組經相應抗原(1640)刺激后IL-4含量比較，P<0.01，#Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組經相應抗原刺激后的IL-4含量比較，P>0.05。B:脾細胞培養上清中細胞因子IFN-γ含量。**與p(Aβ3-10)10-mIL-4組經相應抗原刺激后IFN-γ含量比較P<0.01，#與pcDNA3.1(+)組相應抗原刺激后IFN-γ含量比較，P>0.05。

圖1脾細胞培養上清中細胞因子IL-4與IFN-γ含量

注：3組小膠質細胞免疫熒光結果(A，B，C)；3組老年斑免疫熒光結果(D，E，F)；3組小膠質細胞和老年斑雙表達免疫熒光結果(G，H，I)。標尺=50 μm。

圖2腦組織FITC和TexasRed熒光雙標記小膠質細胞和老年斑結果

3 討論

針對如何阻斷和延遲AD早期Aβ的積聚以及如何消除已形成的Aβ斑塊沉積已經成為近年來AD治療的一個重要研究方向[2]。研究表明，用Aβ42肽免疫AD模型鼠時能夠產生高滴度的抗Aβ抗體，減少鼠腦內Aβ的沉積，并能使鼠的學習和記憶功能得到改善[5,6]。Aβ42肽疫苗(AN1792)在Ⅱ期臨床試驗時，因為6%的病人出現了無菌性腦膜腦炎而被迫停止[7]。隨后的研究認為無菌性腦膜腦炎由T細胞介導的自身免疫反應(Th1型免疫反應)引起[8]。為了建立一種能產生Th2型免疫反應的安全AD免疫，研究者進行了一些實驗性免疫策略的探索。本研究選擇Aβ3-10做為目的基因片段，已有研究證實Aβ1-15是誘導B細胞體液免疫的主要表位[9]，選擇該片段將避免產生T細胞介導的炎癥反應。本研究選擇了Th2型細胞因子IL-4作為佐劑[10]，同時選擇體內電穿孔作為基因遞送途徑[11]，以增強p(Aβ3-10)10-mIL-4的免疫反應。

研究認為主要誘導Th2型免疫反應的免疫方式對于AD的預防和治療是安全的。Th2型免疫反應通過產生IL-4、IL-5等細胞因子增強體液免疫反應；而Th1型免疫反應主要產生IFN-γ、IL-2等細胞因子誘導細胞介導的炎癥反應[12]。本研究中，Aβ42疫苗免疫后，脾細胞體外培養，經自身抗原刺激，分泌的細胞因子IFN-γ和IL-4均較高。p(Aβ3-10)10-mIL-4疫苗免疫后，培養液中IL-4較高，而IFN-γ低。說明Aβ42疫苗引起的免疫反應既有Th1免疫反應，也有Th2 免疫反應，p(Aβ3-10)10-mIL-4疫苗免疫后產生的免疫反應類型為Th2型，這樣就降低了發生炎癥反應副作用的可能性。

阿爾茨海默病的神經炎癥過程是腦內小膠質細胞所參與和介導的一種免疫反應。對AD的病理研究發現活化的小膠質細胞主要圍繞在淀粉樣斑塊的周圍[13]，Aβ與膠質細胞受體結合而使其激活并表達細胞因子，活化的小膠質細胞一方面作為腦內的巨噬細胞可以吞噬沉積的Aβ，減少老年斑的形成；另一方面小膠質細胞激活后產生的大量炎性因子，如IL-6等，可以誘發腦內炎癥反應，或直接損傷神經元[14]。本研究顯示，Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組免疫后，鼠腦內皮層及海馬的小膠質細胞較pcDNA3.1(+)組明顯減少，與老年斑的減少相一致。說明疫苗免疫后轉基因鼠腦內的膠質細胞活化減少，炎癥反應情況得到了改善，從而可以改善神經炎性營養失調，避免神經元的損傷及死亡。

總之，DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫APP/PS1轉基因鼠后能夠產生Th2 免疫反應，減輕小鼠腦內Aβ沉積，同時可以改善鼠腦內的炎癥反應。我們將在后續研究進一步探討p(Aβ3-10)10-mIL-4疫苗的免疫效果及安全性，希望該疫苗能作為AD治療的理想疫苗。