不同劑量液體復蘇對膿毒性休克大鼠炎癥因子調控及安全性評價

田加坤，陳星海，張 敏，李杏良，紀富溪，劉德新*

(1.吉林大學第二醫院 急救醫學科,吉林 長春130041；2.河南省醫院 急診科)

膿毒性休克是目前危重癥醫學領域高發病率和高病死率的疾病，在美國和歐洲，發病率每年以1.5%的速度遞增，原因與免疫系統功能缺陷病人數目的增加、耐藥菌的感染、高風險的手術干預等因素有關，并且病死率隨著年齡和衰竭器官數目的增加而增加[1-6]。液體復蘇是膿毒性休克救治中重要手段之一，《2012嚴重膿毒癥及膿毒性休克管理指南》進一步強化集束化治療策略，強調早期液體復蘇，規定了復蘇目標值，指出對膿毒癥所致組織灌注不足的患者可采取液體沖擊療法，至少按30 ml/kg輸注晶體液，直至患者血流動力學獲得改善[7]。但由于臨床常用的液體復蘇劑量個體差異較大，且部分患者合并心肺功能不全，多大劑量液體復蘇更安全有效，以及液體復蘇對膿毒性休克發病機制方面的影響仍不明確。本研究通過膿毒性休克大鼠模型進行不同劑量液體沖擊復蘇，探討不同劑量液體復蘇對膿毒性休克大鼠的炎癥因子影響及對液體復蘇安全性進行評價，為尋找膿毒性休克時最佳液體復蘇劑量提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

清潔級 S-D 大鼠36只，年齡 6-8周左右，體重為 193.4±11.7 g，購自吉林大學實驗動物中心。復方氯化鈉注射液(四平市巨能藥業有限公司)；大鼠TNF-α、IL-6、IL-10定量ELISA試劑盒購自美國RD公司；BL-420S 生物機能實驗系統購自成都泰盟科技有限公司。

1.2 實驗動物模型制備及液體復蘇方法

膿毒性休克大鼠模型制備:麻醉后大鼠取仰臥位，碘伏消毒中下腹部皮膚備皮后，提起腹部皮膚，用眼科剪于腹白線中點下方約 0.3 cm 處逐層剪開皮膚、肌層和腹膜約 1.5 cm的長度，另只手用平鑷固定肌層，探開腹腔后在直視下，尋找盲腸末端后逐步游離并置于腹腔外；用 4 號縫合線結扎距盲腸末端約 1.5 cm 處，結扎后用直徑1.5 mm大針穿刺針垂直盲腸穿刺 2 孔；針尾帶入20 mm×2.5 mm腹腔引流條2條，貫穿腸管，還納盲腸，4 號線逐層縫合關腹。頸動脈置管連接BL-420S 生物機能實驗系統監測大鼠血壓，大鼠血壓下降為基礎值的30%定義為膿毒癥休克模型制備完成。股靜脈置管為補液做準備。

液體復蘇：將出現血壓下降達到休克的大鼠36只，隨機分為30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液體復蘇組，每組12只，分別按30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg劑量給予液體沖擊補液，待血壓穩定后，減慢輸液速度，若再次出現血壓下降可重復進行不同劑量液體沖擊直至血壓穩定，密切觀察大鼠一般情況及行為學變化等特征情況。

1.3 觀察指標

三組大鼠均在液體復蘇開始、液體復蘇后3小時及液體復蘇后6小時抽血，用ELISA方法測定血清TNF-α，IL-6和 IL-10水平；液體復蘇6小時后處死動物觀察三組大鼠肺、肝、腎、心臟組織結構的病理改變。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 液體復蘇后膿毒性休克大鼠一般情況及行為變化

對膿毒性休克大鼠進行不同劑量液體復蘇，平均2.5-4 h時出現大量尿液。液體復蘇開始時大鼠仍較為活躍，后期逐漸出現豎毛，毛色晦暗，身體捲縮，略發抖，觸之易受驚，活動飲水進食少，偶出現腹瀉，反應遲緩，眼角分泌物增多。

2.2 不同劑量液體復蘇對大鼠血清炎性細胞因子水平的影響

本研究對膿毒性休克大鼠分別給予30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液體復蘇，記錄3組大鼠液體復蘇開始、復蘇3 h、復蘇6 h血清中促炎因子TNF-α、IL-6水平及抗炎因子IL-10水平。發現經過液體復蘇3 h、6 h后，膿毒性休克大鼠的促炎因子TNF-α、IL-6水平較液體復蘇開始時下降，抗炎因子IL-10水平升高，P<0.05。但比較30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液體復蘇3組之間大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-10水平，差異無顯著性，P>0.05。提示液體復蘇能降低膿毒性休克時機體促炎因子水平，同時升高抗炎因子水平，調節炎癥反應失衡。30 ml/kg、45 ml/kg液體復蘇即能抑制全身炎癥反應，繼續加大液體復蘇劑量并未進一步改善全身炎癥反應狀態,結果見表1-3。

表1 不同劑量液體復蘇后大鼠血清TNF-α水平比較

注：※與液體復蘇開始時比較，P<0.05；△各組間比較，P>0.05。

表2 不同劑量液體復蘇后大鼠血清IL-6水平比較

注：※與液體復蘇開始時比較，P<0.05；△各組間比較，P>0.05。

表3 不同劑量液體復蘇后大鼠血清IL-10水平比較

注：※與液體復蘇開始時比較，P<0.05；△各組間比較，P>0.05。

2.3 不同劑量液體復蘇后膿毒性休克大鼠的病理變化

液體復蘇6 h后處死大鼠，大體解剖見結扎處盲腸腫脹嚴重，周圍腸管有化膿現象，且與周圍胰、小腸、胃等組織粘連，有血性腹水及惡臭。其余臟器組織略顯蒼白，臟器表面有散在出血點，肝臟淤血增大。不同劑量液體復蘇組大鼠的肺、肝、腎、心臟大體病理改變無顯著差別。

光鏡觀察三組大鼠液體復蘇6 h后，肺組織出現血小板聚集和纖維蛋白沉積在肺毛細血管，局部可見血管淤血，白細胞浸潤；肺泡蛋白沉積，呈現出富含蛋白質的肺泡水腫，纖維蛋白沉積為透明膜覆蓋肺泡上皮，間質纖維化、肺充血和肺萎陷混合存在。3組間比較無明顯差異，見圖1。

圖1 不同劑量液體復蘇6 h后大鼠肺組織HE染色(400×)

液體復蘇6 h后，3組大鼠肝臟組織可見小葉中心肝竇擴張充血，偶見周圍的單個肝細胞壞死，小葉中心肝細胞壞死或中間地帶枯否氏細胞腫脹，壞死，血栓形成和微肝細胞空泡化，值得注意的是， 60 ml/kg液體復蘇組大鼠肝周可見細胞腫脹，較30 ml/kg、45 ml/kg液體復蘇組明顯，見圖2。

圖2 不同劑量液體復蘇6 h后大鼠肝臟組織HE染色(400×)

液體復蘇6 h后，3組大鼠腎臟可見炎癥細胞浸潤，腎小球腫脹，腎小管上皮細胞腫脹，管型。偶見腎小球毛細血管內存在微血栓形成，腎小管壞死，管腔擴張、腎小管空泡膨脹的嗜堿性粒細胞的變化。3組之間病理改變未見明顯差異。見圖3。

圖3 不同劑量液體復蘇6 h后大鼠腎臟組織HE染色(400×)

液體復蘇6 h后，膿毒性休克大鼠心肌組織可見非特異性的組織學變化，偶見間質水腫，心肌微血管內纖維蛋白沉積、心肌肌纖維排列紊亂。少見心肌壞死、血栓，心內膜和心外膜出血的局限性出血。比較3組大鼠病理改變未見明顯差異。見圖4。

圖4 不同劑量液體復蘇6 h后大鼠心臟組織HE染色(400×)

3 討論

膿毒性休克引起多器官功能障礙的重要發病機制是感染、毒素、以及血流動力學紊亂誘導大量炎癥因子的釋放，凝血功能障礙、進而造成重要臟器損害，其中促炎及抗炎反應失衡是膿毒性休克病理生理過程中的關鍵因素[8,9]。IL-6，TNF-α是重要的促炎因子，可以通過促進炎癥細胞的聚集、活化及炎癥因子的分泌等方式在膿毒性休克的發生、發展中發揮重要的作用，炎癥因子表達的水平與膿毒性休克的嚴重程度及預后密切相關[10-14]。

充分的液體復蘇是治療膿毒性休克的至關重要的措施之一，目前指南推薦的是基于Rivers等于 2001 年提出的“早期目標導向治療” (early goal-directed therapy，EGDT)，強調在動態定量指標的指導下進行滴定式治療。他們研究發現膿毒性休克最初6 h經過積極早期目標導向治療后，患者的28天病死率下降16%[15]。近期也有對EGDT不改變預后提出質疑的聲音，特別是臨床實踐中多大劑量液體能更快速、更安全有效地用于膿毒性休克復蘇并不明確,甚至存在爭議[16-18]。

本研究發現進行液體沖擊治療后大鼠促炎因子表達水平顯著降低，抗炎因子水平則顯著升高，提示30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液體復蘇都可以抑制膿毒性休克炎癥反應的進展，進而可能改善預后。但比較不同劑量液體復蘇組炎癥因子水平，結果顯示組間無顯著性差異，表明30 ml/kg-60 ml/kg液體復蘇對穩定膿毒性休克是有益的，但繼續增加補液量并未對炎癥因子產生明顯的影響，單純采取液體復蘇的手段對膿毒性休克時促炎抗炎反應失衡的調控是有限的，仍需要去除根本病因并采取集束化治療。

本研究中使用不同劑量液體蘇6 h后，觀察各組大鼠肺、肝、腎、心臟的病理改變，并未出現所估計嚴重水腫的出現，組間比較病理改變無顯著性差異。但值得注意的是，在60 ml/kg液體復蘇組發現肝周細胞腫脹，較30 ml/kg、45 ml/kg液體復蘇組明顯。在臨床實踐中，由于積極的液體復蘇常導致液體過負荷，加上毛細血管滲漏等因素，容易加重心、肺、肝、腎等重要臟器損傷,使膿毒性休克的病死率升高。Vicent JL等研究發現，24個國家198個ICU中1177例膿毒癥和1970例非膿毒癥患者相比，每日液體正平衡分別為1.8 L和0.5 L，每日液體正平衡量增加1 L，死亡的危險性便增加10%，而且經過多因素相關性分析證實液體超負荷是導致膿毒癥患者死亡的獨立危險因素[19]。近年來隨著無創和微創血流動力學監測更多的應用于膿毒癥患者的評估證實，避免液體過負荷有利于改善膿毒癥的預后，本研究證實，對于大鼠膿毒性休克模型，30-45 ml/kg的早期液體沖擊復蘇相對安全，繼續加大液體劑量可能有液體過負荷及加重毛細血管滲漏以及組織器官腫脹的風險。