攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌引起兒童醫院感染暴發的研究

張 會，趙 輝,董丹丹，劉真真，賈 楠，朱元祺，*

(1.青島大學醫學院，山東 青島 266071;2.青島大學附屬醫院 檢驗科，山東 青島 266555)

自2001年Yigit等[1]第一個報道產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)臨床分離株以來，攜帶blaKPC-2基因腸桿菌在世界各地傳播開來。2007年國內Wei等首次報道產KPC-2酶的肺炎克雷伯菌浙江分離株。此后，全國各地陸續有檢出KPC-2陽性菌株報道[2]。我們收集2017年4月某兒童醫院分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌株，對其耐藥表型、耐藥基因以及同源性進行研究，以便為采取醫院感染控制措施提供依據，現報道如下。

1 材料和方法

1.1菌株和病人資料9株肺炎克雷伯菌來源于2017年4月分離自某兒童醫院心血管外科(5株)、心血管科(2株)和新生兒科(2株)住院患兒。對病人的病例資料進行回顧性分析，按照2010年1月21日衛生部頒布的《醫院感染診斷標準(試行)》，根據病例資料判定這9例患兒的感染都屬于醫院感染。

菌株鑒定和藥敏試驗采用Vitek-2 Compact系統。藥敏結果判定依據美國臨床實驗室標準化委員會制定CLSI-M100(2017)標準。儀器質控菌株為ATCC25922、ATCC35218、ATCC700603和ATCC27853。

1.2主要儀器和試劑MyCycle型PCR擴增儀和CHEF MAPPER XA型脈沖場凝膠電泳儀為美國Bio-RAD公司； HP3400型全自動凝膠成像系統為美國Alpha Innotech公司。基因組提取試劑盒、瓊脂糖、PCR試劑和核酸分子量標準為大連寶生生物。

1.3耐藥基因的檢測分別檢測碳青霉烯類耐藥基因(blaKPC、blaNDM、blaBIC、blaOXA-48、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaAIM、blaGIM、blaDIM和blaSIM)和超廣譜β-內酰胺酶耐藥基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和blaOXA-1)。耐藥基因的PCR擴增引物序列和方法參照文獻[3]。引物合成和產物測序由生工(上海)生物技術有限公司完成。

1.4多位點序列分型按網站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)提供的7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、tonB、rpoB)引物序列和擴增條件進行菌株的多位點序列分型(MLST)。

1.5脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳(PFGE)的具體操作步驟和結果解釋依據參考文獻和Tenover規則[3,4]。利用BioNumerics7.6軟件，依據Dice系數和UPGMA聚類對脈沖場凝膠電泳進行分析。

2 結果

2.1菌株的藥敏和耐藥基因檢測結果

除了磺胺甲惡唑/甲氧芐啶外， 9株肺炎克雷伯菌對頭孢菌素類、頭霉素類、碳青霉烯酶類、氨基糖苷類和喹諾酮類等抗菌藥物都表現耐藥。經PCR擴增和測序證實，所有菌株都攜帶blaKPC-2基因，其中8株菌還同時攜帶blaCTX-M-65、blaSHV-12和blaTEM-1B基因。結果詳見表1。

表1 產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的藥敏結果和攜帶的基因

2.2菌株多位點序列分型和脈沖場凝膠電泳結果

經對每株菌7個管家基因的擴增、測序和網站比對，除了一株為ST278型外，其他8株菌屬于ST11型。根據Tenover脈沖場凝膠電泳按條帶解釋規則，9株肺炎克雷伯菌分為A、B兩個型。其中，H2、H5、H6和H8號菌株為A型，H3、H4和H10號菌株為A1型，H7號菌株為A2型，H1號菌株為B型。A型及其亞型這8株菌的條帶位置及數目相差小于3條，其多位點序列分型都是ST11型，且相互間脈沖場凝膠電泳聚類分析有92.8%-100%的相似度，這表明存在克隆聚集性。但這8株ST11型與ST278型肺炎克雷伯菌的聚類分析相似度為64.3%，表明存在另一個克隆株。詳見圖1。

注: NO：菌株編號；MLST：多位點序列分型；Date：分離時間；Ward：分離科室；Sample：標本類型。

3 討論

Logan等[5]報道目前國際上碳青霉烯酶耐藥腸桿菌(CRE)產生機制主要是產碳青霉烯酶，ESBLs和/或AmpC合并細菌膜蛋白結構改變。Ambler分類中的碳青霉烯酶包括A、B和D類酶。KPC是A類中最常見的類型。國外代表株是攜帶blaKPC-2或blaKPC-3的ST258型肺炎克雷伯菌，而國內是以攜帶blaKPC-2的ST11型肺炎克雷伯菌最為常見[6]。Tn4401為主要的相關可移動遺傳元件。B類酶又稱金屬酶，以IMP和NDM為主。IMP主要分布在中國、日本和澳大利亞，其中國內以IMP-4和IMP-8多見，常見的相關可移動遺傳元件有IncL/M、IncA/C和I類整合子等；NDM分布于世界各地，常見相關移動遺傳元件有IncA/C和ISAba125等。D類酶主要是OXA-48，我國報道不多，常見于日本、歐洲和北非，代表菌是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，相關可移動遺傳元件有IncL/M、Tn1999、IS1999等[7]。

兒童作為特殊群體，由于對四環素類、喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素的使用受到限制，這使臨床在治療兒童感染耐碳青霉烯類腸桿菌時會面對更多的困難。本研究中，8株攜帶blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌分離自兒童醫院心血管外科、心血管科和新生兒科的住院患兒，分離時間上相近，耐藥表型一致，脈沖場凝膠電泳條帶分布相差小于3條，根據醫院感染診斷標準和Tenover規則，判斷在這三個科室病房患兒中存在攜帶blaKPC-2肺炎克雷伯菌的暴發流行。

近年來，國內外均有碳青霉烯類耐藥腸桿菌在兒童或新生兒群體中暴發感染的報道[8,9]。目前的研究顯示，感染多與抗生素的不合理使用、侵入性操作、菌株定植和住院時間延長等因素有關[10]。由于是回顧性研究，我們沒能采集醫院科室環境標本，以進一步查找感染源和感染途徑。下一步，我們將繼續進行該流行株的基因轉移元件及基因環境的研究。

經檢索，盡管有攜帶blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌散發和暴發的病例報道[9]，但沒有與該流行菌株攜帶的其他耐藥基因相一致的報道，即攜帶blaKPC-2、blaCTX-M-65、blaSHV-12和blaTEM-1B基因的ST11型肺炎克雷伯菌引起病房患兒醫院感染暴發是國內外首次報道。因此，應引起臨床重視，并加強對碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的監測和抗生素的合理使用。