模式識別受體NOD2在髓樣分化蛋白88缺陷小鼠抗分枝桿菌感染中的作用機制

梁錦屏 ， 陳少紅 ， 張 倩 ， 湯業珍 ， 韓懷欽 ， 魏 軍

結核病（Tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的慢性傳染病。據世界衛生組織最新統計，全球有17億人感染結核分枝桿菌，占全世界人口的23%[1]。我國作為全球30個結核病高負擔國家之一，年發病人數約為130萬，居全球第二位。寧夏作為全國及西部地區結核病高發重點省區之一，疫情長期處于傳染病報告前列。加之近年來耐多藥結核分枝桿菌的流行和廣泛耐藥結核分枝桿菌的出現，結核分枝桿菌/HIV共感染患者持續增加以及流動人口的增多等因素，給公共衛生帶來嚴峻的挑戰。

近年來隨著天然免疫識別機制研究的突破性進展，對結核分枝桿菌的致病機制有了進一步的認識。機體多種細胞通過不同的模式識別受體識別結核分枝桿菌的結構成分，啟動細胞內信號轉導。其中Toll樣受體（TLR）通路中髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴途徑，通過激活MyD88及相應的下游效應因子活化 NF-κB，啟動相應的基因轉錄，發揮抗炎作用[2-3]。但目前研究中對肺組織TLR與NOD2信號通路的關系，以及兩條通路在結核分枝桿菌感染時，是否存在相互影響、共同調節的免疫機制仍不清。因此本研究以髓樣分化蛋白88缺陷（MyD88-/-）小鼠（C57BL為遺傳背景）感染分枝桿菌為切入點，探討TLR通路中的MyD88依賴途徑受阻時，肺組織中NOD2信號在抗分枝桿菌感染中發揮的作用，為進一步闡明NOD2信號與TLR信號通路在呼吸道相互作用機制，揭示結核分枝桿菌致病機制、尋求臨床免疫治療或設計新型疫苗提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 MyD88-/-小鼠購自南京大學模式動物研究所，野生型C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，6～8周齡，18～22 g，由寧夏醫科大學醫學實驗動物中心在SPF條件下飼養繁殖，動物飼養及實驗操作嚴格遵守實驗動物的使用和管理原則。MyD88-/-小鼠均經PCR重復鑒定無誤。

1.1.2 試劑 NOD2抗體（ABclonal公司，美國）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）、ECL化學發光液（Amersham，美國）、RNA提取試劑盒（天根生化科技公司）、全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）、蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物科技發展有限公司）、PVDF膜（Millipore，美國）、β-肌動蛋白（SANTA CRUZ）、小鼠白介素6（IL-6）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（深圳達科為生物技術股份有限公司）、RT-PCR試劑盒（TransGen Biotech），引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗分組及模型建立 將實驗分為MyD88-/-和野生型C57BL/6兩大組，每大組再各分為分枝桿菌減毒株（卡介苗，BCG）組和磷酸緩沖鹽溶液（PBS）組，共4組，每組小鼠6只。每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛進行麻醉，5 min后麻醉生效，采用非暴露式氣管滴注方法，BCG組經氣管滴注50 μL BCG菌液（1×106cfu/mL），PBS組經氣管滴注50 μL無菌PBS。而后用細棉線掛住小鼠上齒，將其直立，垂直旋轉，使液體在肺內均勻分布，建立小鼠肺部感染和對照模型，24 h后取材。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測 肺組織中NOD2基因表達 NOD2的引物序列：F 5'GCTTCGAGGGAACACATTCT 3'，R 5'CCCTACAGTCCACTCACAAAC 3'。反轉錄反應條件 ：42℃孵育 30 min，85℃加熱 5 min反轉錄為cDNA。在熒光定量PCR儀上按照熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR反應。

1.2.2 Western Blot法檢測小鼠肺組織中NOD2的蛋白表達 按照全蛋白提取試劑盒說明提取小鼠肺組織中的全蛋白，并參考BCA 蛋白定量檢測試劑盒對其進行定量。然后進行SDS-PAGE電泳，半干轉至PVDF膜，濃度5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入特異性一抗于4℃過夜孵育，次日平衡到室溫，PBST漂洗3次后，加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，PBST漂洗3次后用ECL底物顯色，蛋白成像系統曝光檢測。

1.2.3 ELISA法檢測外周血中的IL-6含量 摘眼球取血，靜置2 h，離心后收集血清，每管150 μL分裝保存于-80℃，待測。按照小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒說明檢測，根據標準曲線，計算出IL-6的含 量。

1.2.4 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多樣本均數間比較采用One-Way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織中NOD2基因的表達

MyD88-/-和野生型小鼠經氣管滴入BCG 24 h后，取肺組織提取RNA，利用熒光定量PCR技術檢測兩組NOD2基因的表達。MyD88-/-小鼠肺組織中NOD2表達顯著高于野生型小鼠，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 MyD88-/-與野生型小鼠肺組織中NOD2基因表達Figure 1 The expression of NOD2 gene in lung tissues of MyD88-/- mice and wild type mice

2.2 肺組織中NOD2的蛋白表達

經Western Blot對各組小鼠肺組織中NOD2蛋白表達情況進行檢測，結果顯示，BCG感染組相比PBS對照組NOD2蛋白表達量顯著升高；而MyD88-/-小鼠相比野生型小鼠NOD2蛋白表達量更高；兩種小鼠中BCG感染組均比PBS對照組NOD2蛋白表達量更高。見圖2。

圖2 MyD88-/-與野生型小鼠不同處理后肺組織NOD2蛋白表達Figure 2 The expression of NOD2 protein in lung tissues of MyD88-/- mice and wild type mice

2.3 外周血IL-6的水平

氣管滴注P B S后，M y D 8 8-/-小鼠I L-6[（69.37±30.63）pg/mL]與野生型小鼠IL-6[（56.21±26.42）pg/mL]水平差異無統計學意義。BCG感染后，MyD88-/-小鼠IL-6水平顯著增高[（331.84±22.59）pg/mL]，與野生型小鼠[（297.79±49.34）pg/mL]間無顯著差異，但均比同型小鼠的PBS對照組明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-6含量Figure 3 Serum IL-6 level in MyD88-/- mice and wild type mice determined by ELISA

3 討論

NOD2和TLR作為重要的固有免疫模式受體，是機體抵御病原微生物入侵的第一道屏障，既是固有免疫的始動因素，同時又是獲得性免疫應答的調節因素。其中NOD樣受體（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor，NLR）是胞內模式識別受體，最初認為NOD2識別脂多糖 （LPS）可不通過 TLR4受體直接激活 NF-κB 從而介導免疫炎性反應。現在發現NOD2能夠識別的配體是廣泛存在于革蘭陰性菌、革蘭陽性菌細胞壁中的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）。NOD2由3個結構域組成，當C末端富含亮氨酸重復序列LRR探測識別配體后，會引起自身構象發生變化，暴露出位于受體分子中央的NOD結構域，觸發寡聚體化與活化，繼而暴露具有caspase活化募集的效應結構域（CARD）——絲氨酸/蘇氨酸激酶RICK（又稱RIP2或RIPK2），活化的受體作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，RIP2）介導IKKγ泛素化，誘導NF-κB的轉錄。此外NOD2還能活化MAPK激酶通路中的p38與ERK。有研究發現NOD2-/-小鼠中肺泡巨噬細胞分泌抗炎因子減少，難以控制胞內結核分枝桿菌的增殖，表明NOD2有助于巨噬細胞控制結核分枝桿菌的慢性感染。研究顯示，NOD2與TLR在機體抵抗病原體的反應中具有協同作用[4]。TLR耐受會增加機體重復感染的風險。有研究發現，在耐受的小鼠巨噬細胞中，NOD2基因的表達及活化明顯增加；NOD2基因敲除后，小鼠對病原菌的易感性明顯增加[5]。而本實驗利用MyD88-/-小鼠建立BCG感染肺部模型，檢測NOD2基因及蛋白的表達。結果提示，小鼠在MyD88依賴途徑功能缺失時，NOD2信號可補充發揮免疫作用。這與Khan等[5]、Krishnaswamy等[6]、Compan等[7]的研究中如果缺乏TLR，細菌的識別依靠NOD1和 NOD2相一致。該結論體現了機體固有免疫系統中模式識別受體間的互作調控作用，即TLR信號介導的MyD88依賴途徑受阻時，機體可利用另一種模式識別受體NOD2發揮抗感染免疫。

IL-6是一種重要的參與機體應激反應和免疫調節的細胞因子，參與肺部炎癥的病理發展過程，在維持機體免疫防御與免疫自穩中發揮重要作用。本實驗結果中BCG感染后，MyD88-/-小鼠與野生型小鼠IL-6水平較PBS組顯著增高，但MyD88-/-小鼠與野生型小鼠IL-6的水平并無顯著差異。機體感染分枝桿菌后，可通過激活其他通路，如TLR介導的MyD88非依賴途徑、NLR、甘露糖受體、C型凝集素受體（C-type lectin receptor）及表面活性物質蛋白A受體（surfactant protein A receptors）等，以識別結核分枝桿菌的組成成分，啟動細胞內信號轉導通路，誘導特異性基因表達，分泌細胞因子和趨化因子發揮作用[8]。這也進一步暗示機體的免疫調控是復雜的網絡體系，各信號通路之間往往存在相互作用與聯系。本研究中MyD88-/-小鼠IL-6水平顯著增高，是否有NOD2參與，課題組將后續利用NOD2-/-小鼠進行更深入的研究。