念珠菌血癥的臨床特征及其與（1， 3）-β-D葡聚糖的關系

申 旺，楊文麗， 陳彥波， 李月桂， 鐘一梅， 張 鑫

關健詞： 念珠菌血癥； (1，3)-β-D-葡聚糖； 培養； 定植

隨著醫療技術的快速發展，器官和骨髓移植的大量開展，各種導管插管等侵襲性治療技術的應用，以及抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用等，侵襲性真菌感染患者逐年增多[1]。念珠菌血癥是侵襲性真菌感染中最常見的類型，約占醫院血流感染的6%～11%[2]。念珠菌血癥臨床表現呈多樣性，常合并其他并發癥，治療難度大，病死率高。如何在早期及時診斷念珠菌血癥是目前臨床面臨的難題。(1, 3)-β-D葡聚糖是念珠菌細胞壁的主要成分，研究已證實其可用于侵襲性真菌感染的早期診斷[3]。念珠菌深部定植和外科手術均被認為是引起念珠菌血癥的重要因素[4]，本研究主要通過對念珠菌血癥患者和念珠菌深部定植患者的臨床資料和血清(1, 3)-β-D葡聚糖水平進行比較，分析念珠菌血癥患者的臨床特征和(1, 3)-β-D葡聚糖的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 對2015年9月－2018年3月于江門市五邑中醫院住院患者進行回顧性分析，發現血培養念珠菌陽性，且排除可能的污染，同時表現出念珠菌感染體征的念珠菌血癥[5]患者31例，其中男19例，女12例，平均年齡64.6歲（34～91歲）；同期在胸水、腹水、膽汁等引流液標本中培養出念珠菌，但血培養為陰性，無相應臨床表現的39例患者作為念珠菌深部定植組[4]，其中男21例，女18例，平均年齡55.3歲（29～87歲）。詳細記錄兩組患者的臨床資料，包括性別、年齡、手術、基礎疾病、藥物使用情況、體內留置導管等情況。同時選擇50名健康體檢人員作為健康對照組，其中男28名，女22名，平均年齡48.9歲（24～74歲）。入選對象均排除了抽血前2周內進行透析、輸注白蛋白和免疫球蛋白及使用過抗腫瘤多糖類藥物的患者。

1.1.2 儀器與試劑 法國生物梅里埃公司BacT/AlerT 3D全自動血培養儀及其配套的血培養瓶；沙保弱真菌顯色培養基；上海躍進SPX-400-Ⅱ真菌生化培養箱；法國生物梅里埃公司ATB Expression半自動微生物鑒定儀及其配套的細菌和真菌鑒定試劑盒；廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的血漿(1, 3)-β-D葡聚糖檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 真菌培養和鑒定 按照《全國臨床檢驗操作規程》，以無菌操作的原則采集念珠菌血癥患者和念珠菌深部定植患者的血液5～10 mL和胸腹水、膽汁等引流液分別接種于雙套血培養瓶和血平皿、沙保弱平皿中，血培養瓶放置BacT/AlerT 3D全自動血培養儀中培養7 d，若報警陽性，則轉接血平皿、沙保弱平皿；若平皿有細菌和真菌生長，則采用微生物鑒定試劑和鑒定儀進行鑒定。多次血培養陽性患者以首次培養陽性的結果為 準。

1.2.2 G試驗 按照(1, 3)-β-D葡聚糖檢測試劑說明書進行操作，嚴格遵守無菌操作原則。健康對照組人群檢測1次，念珠菌血癥組和念珠菌深部定植患者均檢測2次，結果以首次檢測出陽性結果和天數為準。血漿(1, 3)-β-D葡聚糖≥10 pg/mL為陽性。

1.2.3 統計學分析 用統計學軟件SPSS 19.0進行統計分析。計量資料采用四分位數Q（P25，P75）描述，組間的比較采用秩和分析。計數資料采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 念珠菌血癥患者病原菌分布情況

在31例念珠菌血癥患者的血液中培養出13株白念珠菌，18株非白念珠菌（包括9株熱帶念珠菌、5株光滑念珠菌、2株克柔念珠菌和2株近平滑念珠菌）。同時還從14例念珠菌血癥患者血液中培養出細菌，其中5例是細菌合并白念珠菌血癥，9例是細菌合并非白念珠菌血癥。

2.2 念珠菌血癥患者的臨床特征

將念珠菌血癥患者和念珠菌深部定植患者的臨床資料進行比較，發現念珠菌血癥更容易發生在＞65歲、7 d內有手術史、留置導管≥2根且留置時間≥5 d、持續機械通氣≥5 d的患者中（P＜0.05），而與患者性別、基礎疾病、免疫抑制劑或糖皮質激素使用情況、廣譜抗生素和抗真菌藥物同時使用情況、低蛋白血癥無關（P＞ 0.05），見表1。

表1 念珠菌血癥與念珠菌深部定植患者的臨床特征比較Table 1 Clinical characteristics of patients in terms of Candida infection

2.3 各組患者的血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平和陽性率比較

念珠菌血癥患者的血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平均顯著高于念珠菌深部定植組（z=-3.135，P=0.018）和健康對照組（z=-7.245，P＜0.001），念珠菌深部定植組的血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平均顯著高于健康對照組（z=-5.484，P＜0.001）。以健康對照組作為對照，分析血漿(1, 3)-β-D葡聚糖在念珠菌血癥患者中的診斷價值，發現其診斷念珠菌血癥的特異度為96.0%（48/50），靈敏度為87.1%（27/31），顯著高于念珠菌深部定植組的靈敏度56.4%（22/39），差異有統計學意義（χ2=7.745，P=0.005），見表2。

表2 各組患者血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平和靈敏度分析Table 2 Serum level of (1, 3)-β-D glucan compared between groups and sensitivity analysis

2.4 血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平與念珠菌血癥病原菌間關系

31例念珠菌血癥患者中，17例血培養為單一念珠菌，包括8例白念珠菌和9例非白念珠菌；14例血培養中同時培養出細菌。合并細菌感染的念珠菌血癥患者血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平顯著高于單一念珠菌血癥患者（P=0.021），單一白念珠菌感染組患者血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平顯著高于單一非白念珠菌感染組（P=0.014），見表3。

表3 血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平在念珠菌血癥患者各組中的比較Table 3 Serum (1, 3)-β-D-glucan level in terms of candidemia etiology

3 討論

念珠菌是一類在自然界分布最廣、引起人體感染最常見的機會致病性真菌。念珠菌常定植在正常健康人群的口腔、表皮、胃腸道和陰道黏膜中，一般不會導致疾病，當人體免疫功能受損、黏膜被破壞時，念珠菌可侵入到組織或器官中，引發侵襲性念珠菌感染，其中最常見的臨床表現形式就是念珠菌血癥[6]。因其常合并其他并發癥且不易被發現，故患者病情較危重，病死率高。

以往報道顯示白念珠菌是念珠菌血癥的首要感染病原體，占總念珠菌菌種的50%～70%，然而根據美國1998－2006年52所不同醫院的統計[7]和2008－2012年上海多所醫院的數據[8]，發現近年非白念珠菌感染率逐步上升。在本研究的31例念珠菌血癥患者中，白念珠菌占41.9%，低于非白念珠菌的58.1%，但仍是分離培養最多的單一念珠菌種，與國內外研究基本一致[9-10]，這可能與臨床對真菌感染的意識增強，大量使用預防性抗真菌藥物尤其是抗白念珠菌藥物有關。本研究中分離鑒定的非白念珠菌種以熱帶念珠菌和光滑念珠菌為主，與陳玉等[11]研究略有出入，這可能與地域性差異及樣本收集的類型和數量不同有關。馬春芳等[12]研究顯示熱帶念珠菌感染主要與患者的年齡、腫瘤、手術相關，光滑念珠菌感染則與患者前期使用抗真菌藥物相關。

既往研究顯示引起念珠菌血癥的危險因素包括外科手術、廣譜抗菌藥物應用、腫瘤、糖尿病、免疫抑制劑治療或者免疫功能低下、中心靜脈導管等[13-15]。這些其實也是其他真菌感染和念珠菌深部定植的危險因素，同時念珠菌在機體深部大量定植又是念珠菌血癥發生的預警指標，當機體組織或器官黏膜遭破壞時，定植在此處的念珠菌極易通過黏膜屏障，侵入血液或組織器官，導致念珠菌血癥。為了進一步探索念珠菌血癥的特征，本研究特意對念珠菌血癥患者和念珠菌深部定植患者的臨床特征進行了比較分析。研究發現念珠菌血癥更容易發生在＞65歲、7 d內有手術史、體內留置導管≥2根且留置時間≥5 d、持續機械通氣≥5 d的患者中（P＜0.05），而與性別、基礎疾病、抗菌藥物和免疫抑制劑的應用、低蛋白血癥等無關（P＞0.05）。這可能是因為機體免疫力隨著年齡的增加逐漸下降；另外手術、各種插管和留置導管等有創性操作導致人體的皮膚屏障、黏膜屏障等免疫屏障被破壞，血液暴露等。

早期診斷和早期治療是改善念珠菌血癥患者預后的關鍵，其中早期診斷尤為關鍵。目前臨床最常采用的檢測方法是血培養，同時也是念珠菌血癥診斷的金標準，血培養可以鑒定出念珠菌種類并測定藥敏結果，對臨床診斷和治療念珠菌血癥有很重要的指導意義。但血培養時間長，需3～5 d，常延誤患者的診斷和治療，同時血培養操作過程中易受其他雜菌的污染，故不利于念珠菌血癥的早期診斷。念珠菌抗體檢測如甘露聚糖抗體、烯醇化酶抗體等，雖然在念珠菌感染患者中的陽性率較高，但在不同念珠菌菌種中的抗原抗體反應強度并不一致，如在近平滑念珠菌和克柔念珠菌中效果較差；即使陽性結果也無法判斷患者是既往感染還是現行感染；在免疫功能低下和應用免疫抑制劑的患者中還可出現假陰性，也不利于念珠菌血癥患者的早期診斷。分子生物學方法雖可早期診斷，但因念珠菌胞壁厚實堅硬，DNA提取困難，故難以應用于臨床。念珠菌定植指數和念珠菌評分只是一種念珠菌感染的篩查手段，而非診斷指標。因此，尋找一種新的診斷指標勢在必行。(1, 3)-β-D葡聚糖存在所有念珠菌菌種中，占細胞壁含量的50%以上。當念珠菌侵入人體組織或血液時，經吞噬細胞的吞噬和消化作用，(1, 3)-β-D葡聚糖可從細胞壁中釋放至體液或血液，從而導致其濃度立即增高，并隨著念珠菌含量的減少迅速下降；當念珠菌只是定植或淺部感染時，(1, 3)-β-D葡聚糖不會被釋放出來[16-17]。(1, 3)-β-D葡聚糖試驗操作簡單、方便快捷，因此可用于念珠菌血癥的早期診斷。

本研究中，念珠菌血癥患者的血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平顯著高于健康對照組（P＜0.001）和念珠菌深部定植組（P=0.018），差異有顯著統計學意義。念珠菌深部定植組的血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平與健康對照組相比，差異也有統計學意義（P＜0.001），這可能與患者菌種失調導致念珠菌大量定植和繁殖或細菌感染造成的假陽性有關。以健康人群作為對照，發現血漿(1, 3)-β-D葡聚糖診斷念珠菌血癥的特異度為96.0%，靈敏度為87.1%，顯著高于念珠菌深部定植組的靈敏度（56.4%），差異有統計學意義（P=0.005），并且(1, 3)-β-D葡聚糖在念珠菌侵入血液的早期就可升高，表明血漿(1, 3)-β-D葡聚糖在念珠菌血癥的早期診斷中具有較高的應用價值，其水平高低也有助于區分念珠菌血癥與念珠菌深部定植。一項隊列研究表明，對于在ICU住院超過5 d的重癥患者，血漿(1, 3)-β-D葡聚糖對念珠菌血癥的靈敏度和特異度分別為93%和94%[18]。(1, 3)-β-D葡聚糖檢測也存在局限性，一方面其不能區分具體念珠菌種類型，另一方面在長期接受纖維膜透析的患者，接受白蛋白、球蛋白、凝血因子等血制品治療的患者中可呈假陰性。因此，對疑似念珠菌血癥患者建議盡早同時進行(1, 3)-β-D葡聚糖檢測和血培養。

本研究發現念珠菌血癥患者的(1, 3)-β-D葡聚糖水平與是否合并細菌感染和念珠菌菌種有關。合并細菌感染的念珠菌血癥患者血漿(1, 3)-β-D葡聚糖濃度較單一念珠菌血癥患者高，差異有統計學意義（P=0.021）。有研究顯示念珠菌與金黃色葡萄球菌、鏈球菌共同培養時，可形成混合型生物膜，相互刺激對方生長，存在共生及協同作用[19-20]；而當念珠菌與銅綠假單胞菌一起生長時，會產生金合歡醇抑制銅綠假單胞菌繁殖，存在拮抗作用[21]。由于本研究標本量較小，未對革蘭陽性球菌和革蘭陽性桿菌感染念珠菌血癥患者進行比較分析，是本研究的不足之處。本研究還發現單一白念珠菌血癥患者的血漿(1, 3)-β-D葡聚糖水平顯著高于單一非白念珠菌血癥患者，差異有統計學意義（P=0.014）。這可能與白念珠菌細胞壁(1, 3)-β-D葡聚糖含量高，以及白念珠菌能釋放磷脂酶進一步促進其侵襲深部組織有關。

綜上所述，白念珠菌雖在念珠菌血癥感染中的比例有所下降，但仍是最常見的念珠菌菌種；念珠菌血癥易發生在高齡（＞65歲）、7 d內有手術史、有多根體內插管導管且持續時間長、機械通氣時間長（≥5 d）的患者中；(1, 3)-β-D葡聚糖可用于念珠菌血癥中早期診斷。