2011－2016年上海市兒童醫院臨床分離細菌耐藥性監測

王 春， 姚劍杰， 孫 燕， 秦惠宏， 潘 芬， 石迎迎， 張 泓， 葛青瑋

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌 收集2011年1月—2016年12月上海市兒童醫院臨床分離的菌株，剔除同一患者分離的重復菌株及非無菌部位分離到的凝固酶陰性葡萄球菌。

1.1.2 培養基 參照美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）[3]推薦采用需氧菌藥敏培養基：MH瓊脂培養基（上海伊華生物技術公司）；苛氧菌藥敏瓊脂培養基：5%脫纖維羊血MH瓊脂、HTM瓊脂（上海科瑪嘉生物技術公司）。

1.1.3 抗菌藥物紙片和E試驗條 抗菌藥物紙片均為英國OXOID公司產品；青霉素、萬古霉素和替考拉寧E試驗條為法國生物梅里埃公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌藥敏試驗 采用紙片擴散法行藥敏試驗，結果參照CLSI 2016年標準[3]判斷，磷霉素的判斷標準僅針對尿標本分離的糞腸球菌；替加環素的判斷標準參照美國食品和藥品監督管理局（FDA）文件標準。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌產酶株ATCC 35218、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853、糞腸球菌ATCC 29212、肺炎鏈球菌ATCC 49619、流感嗜血桿菌ATCC 49247。

1.2.2 β內酰胺酶檢測[3]采用頭孢硝噻吩試驗定性檢測流感嗜血桿菌的β內酰胺酶。按CLSI推薦的紙片法篩選和酶抑制增強確證試驗檢測大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌中的產超廣譜β內酰胺酶（ESBL）菌株。

1.2.3 青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PNSP）的檢測 經苯唑西林紙片法測定抑菌圈直徑≤19 mm的肺炎鏈球菌采用青霉素E試驗條測定其最低抑菌濃度（MIC），腦膜炎分離株和非腦膜炎分離株分別按CLSI 2016年標準[3]判定為青霉素敏感、中介或耐藥株（PSSP、PISP或PRSP）。

1.2.4 耐萬古霉素腸球菌（VRE）檢測 經萬古霉素紙片法測定結果為非敏感株者用萬古霉素和替考拉寧E試驗條[3]復測確認。

2) 冷卻著火儲罐罐壁。針對著火儲罐罐壁進行冷卻，減少罐內油品熱傳導，一定程度上能避免沸溢。研究表明，有罐壁冷卻比無罐壁冷卻的油品燃燒線速度減小25%～30%，采用冷卻措施后儲罐發生沸溢時間有所延長，但儲罐如已形成熱層，罐壁冷卻措施的作用將有限。

1.2.5 特殊耐藥菌株定義 廣泛耐藥菌（XDR）指對除多黏菌素和替加環素外的其他抗菌藥物全部耐藥的菌株[4]。碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（CRE）定義[4]為對亞胺培南、美羅培南或厄他培南中任一種藥物耐藥者。

1.3 數據分析

采用WHONET 5.6軟件對所有數據進行統計分 析。

2 結果

2.1 細菌及其分布

2011－2016年共分離到臨床菌株23 259株，其中革蘭陽性菌10 885株（46.8%），革蘭陰性菌12 374株（53.2%）。6年中每年革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的占比及主要細菌占比見表1 ，基本無明顯差異。革蘭陽性菌主要以鏈球菌屬和金黃色葡萄球菌多見；革蘭陰性菌主要以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌多見。

23 259株細菌中，住院和門診患者各占84.0%和16.0%。標本分布情況顯示：痰液等呼吸道標本占52.3%、血液13.6%、尿液12.7%、傷口膿液6.3%、糞便4.8%、無菌體液2.0%、陰道拭子1.0%和其他標本7.3%。呼吸道標本仍以肺炎鏈球菌（22.7%）為主，血液標本以凝固酶陰性葡萄球菌（71.6%）為主，尿液標本以大腸埃希菌（52.3%）為主。

2.2 革蘭陽性球菌對抗菌藥物的耐藥性

2.2.1 鏈球菌屬 2 916株肺炎鏈球菌中，腦膜炎株9株，非腦膜炎株2 907株。9株腦膜炎分離株中，1株對青霉素敏感，其余均為青霉素耐藥株。2 907株非腦膜炎肺炎鏈球菌中PNSP的檢出率為31.2%，PSSP的檢出率為68.8%。藥敏結果顯示肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素耐藥率最高（＞90%），對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率較高（＞65%），未發現喹諾酮類、萬古霉素、利奈唑胺耐藥株，見表2。

表1 2011－2016年主要臨床分離菌的分布Table 1 Distribution of bacterial species isolated from children between 2011 and 2016[n ( % ) ]

表2 2011－2016年非腦膜炎肺炎鏈球菌對抗菌藥物的耐藥率Table 2 Resistance of non-meningitis S. pneumoniae to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

β溶血鏈球菌中主要以化膿鏈球菌為主，對紅霉素和克林霉素耐藥率高（＞90%），未發現對青霉素、頭孢曲松、萬古霉素和利奈唑胺耐藥菌株，見表3。無乳鏈球菌對青霉素、頭孢曲松保持較高敏感率（＞90%），對紅霉素、克林霉素耐藥率為50%左右，未發現萬古霉素、利奈唑胺耐藥菌株。

2.2.2 葡萄球菌屬 葡萄球菌屬中，MRSA和MRCNS分別占各自菌種的35.8%和82.2%。MRSA和MRCNS對β內酰胺類、大環內酯類、氨基糖苷類和喹諾酮類的耐藥率均顯著高于MSSA和MSCNS。未發現對利奈唑胺、萬古霉素和替考拉寧耐藥的葡萄球菌。見表4、表5。

表3 2011－2016年化膿鏈球菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of Streptococcus pyogenes to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表4 2011－2016年金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 4 Susceptibility of S. aureus to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表4 （續）Table 4（continued）（%）

表5 2011－2016年凝固酶陰性葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 5 Susceptibility of coagulase negative Staphylococcus to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

2.2.3 腸球菌屬 953株腸球菌屬中，糞腸球菌428株（44.9%），屎腸球菌365株（38.3%），其他腸球菌160株（16.8%）。屎腸球菌對所測試的抗菌藥物耐藥率高于糞腸球菌。目前未發現對萬古霉素、利奈唑胺和替考拉寧耐藥菌株。見表6。

2.3 革蘭陰性桿菌對抗菌藥物的耐藥性

2.3.1 腸桿菌科 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBL平均檢出率分別是61.1%和75.1%。產ESBL菌株對所測試藥物的耐藥率均比非產ESBL株高。大腸埃希菌對碳青霉烯類最敏感，耐藥率＜3%，其次為阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦和頭孢哌酮-舒巴坦，6年總體耐藥率分別為4.4%、4.8%、6.6%。各年大腸埃希菌對所測試抗菌藥物耐藥率和敏感率見表7。

表6 2011－2016年糞腸球菌和屎腸球菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 6 Susceptibility of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016

表7 2011－2016年大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 7 Susceptibility of Escherichia coli strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表7 （續）Table 7（continued）（%）

6年間肺炎克雷伯菌對所測試抗菌藥物耐藥率整體呈上升趨勢，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別由2011年的3.1%和4.8%上升至28.7%和37.4%，對阿米卡星、環丙沙星的耐藥率分別從3.1%和5.8%上升至36.1%和47.5%，對哌拉西林-他唑巴坦和頭孢哌酮-舒巴坦分別從20.6%和14.2%上升至50.4%和49.9%，對頭孢菌素的耐藥率也呈上升趨勢，2016年耐藥率＞65%，見表8。

表8 2011－2016年肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 8 Susceptibility of Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

6年共分離到272株鼠傷寒沙門菌和235株腸炎沙門菌，兩者對氨芐西林耐藥率較高（＞70%）。腸炎沙門菌對甲氧芐啶-磺胺甲唑、氯霉素的敏感率＞90%，鼠傷寒沙門菌對頭孢曲松的敏感率最高（75.8%），其次是甲氧芐啶-磺胺甲唑（64.2%）。見表9。

2.3.2 不發酵糖革蘭陰性桿菌 2011－2016年共分離739株銅綠假單胞菌和1 366株鮑曼不動桿菌。各年對抗菌藥物耐藥率見表10、表11。銅綠假單胞菌對所測試抗菌藥物耐藥率變化不大，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為15%左右。鮑曼不動桿菌對大多數抗菌藥物的耐藥率呈上升趨勢，除了對頭孢哌酮-舒巴坦的耐藥率為26.7%，對其他所測試抗菌藥物的耐藥率大多＞50%，對碳青霉烯類（亞胺培南和美羅培南）耐藥率較高，6年總體耐藥率分別是62.7%和63.5%。

2.3.3 XDR革蘭陰性桿菌 革蘭陰性桿菌中，XDR細菌主要有鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌，其中鮑曼不動桿菌6年XDR占比呈逐年下降趨勢（27.3%下降到20.0%）；而肺炎克雷伯菌呈上升趨勢（0上升到14.9%），見表12。

2.3.4 流感嗜血桿菌 6年共分離流感嗜血桿菌1 747株，β內酰胺酶檢出率40.7%。流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥率48.6%，對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率最高為71.2%，對頭孢噻肟、環丙沙星、阿奇霉素的不敏感率分別為14.4%、4.5%、17.6%，見表13。

表9 2011－2016年沙門菌屬對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 9 Susceptibility of Salmonella spp. strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表10 2011－2016年銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 10 Susceptibility of P. aeruginosa strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

表11 2011－2016年鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 11 Susceptibility of A. baumannii strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

3 討論

統計2011－2016年我院細菌數據結構顯示：革蘭陽性菌和陰性菌所占比率均保持在50%左右，與同期2011－2015年CHINET細菌耐藥性監測數據存在一定的差異[5-8]。6年間以鏈球菌屬總體檢出率最高（17.1%，3 982/23 259），主要以肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌多見，這與綜合性醫院檢出情況存在一定差異，且上述細菌主要分離自呼吸道標本，這可能與兒童人群上呼吸道感染主要以化膿鏈球菌多見，下呼吸道感染主要以肺炎鏈球菌多見這一現象存在一定的相關性。

表11 （續）Table 11（continued）（%）

表12 2011－2016年XDR革蘭陰性菌分離情況Table 12 Prevalence of XDR gram-negative strains by year from 2011-2016

表13 2011－2016年流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 13 Susceptibility of H. in fl uenzae strains to antimicrobial agents by year from 2011 to 2016（%）

6年中我院監測到的臨床菌株主要來源于痰液等呼吸道標本（52.3%），其次為血液（13.6%）和尿液（12.7%）標本，與2011－2016年CHINET細菌耐藥監測數據結構一致[5-9]。呼吸道標本仍是臨床上最常見的樣本，與我院呼吸科床位數比例較高（占全院病床數的10%）有一定關系。不同標本中分離到細菌的種類差異較大，痰液等呼吸道標本中以肺炎鏈球菌（22.7%）、金黃色葡萄球菌（19.2%）和流感嗜血桿菌（13.8%）為主；咽拭子以化膿鏈球菌（54.0%）和金黃色葡萄球菌（9.1%）為主，這一結果顯示兒童呼吸系統感染主要以苛養菌為主，與成人明顯不同[9]。血液標本以凝固酶陰性葡萄球菌（71.6%）、肺炎克雷伯菌（3.9%）和大腸埃希菌（3.8%）為主；尿液標本以大腸埃希菌（52.3%）、糞腸球菌（7.6%）和屎腸球菌（7.3%）為主；糞便標本中沙門菌的分離率在增加，志賀菌有所減少，可能與民眾生活條件改善有關。

本次監測中金黃色葡萄球菌在革蘭陽性菌中檢出率最高，也是引起醫院和社區呼吸道感染的主要病原菌。6年間MRSA主要分離自呼吸道標本，其次為傷口膿液，分離率由2011年27.4%上升至2016年42.9%，而2011－2016年CHINET細菌耐藥監測數據顯示成人MRSA檢出率不斷下降（從2011年60.1%持續下降到2016年的38.4%），這一現象需引起重視。6年來門診患兒檢出金黃色葡萄球菌228株，其中MRSA檢出率為20.2%（46/228）；住院患者檢出金黃色葡萄球菌2 903株，其中MRSA檢出率37.0%（1 074/2 903），住院患者MRSA分離率高于門診患者[9]。MRCNS略有下降，由2011年87.0%下降至2016年79.6%，主要分離自血液及無菌體液標本。MRSA和MRCNS對所測試抗菌藥物的耐藥率顯著高于MSSA和MSCNS。MRSA對利福平和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率較低（＜15%），MRCNS對利福平的耐藥率＜10%，對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率顯著高于MRSA，兩者均未發現對萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧耐藥株。

肺炎鏈球菌是檢出率僅次于金黃色葡萄球菌的革蘭陽性菌，可引起兒童細菌性肺炎、腦膜炎和急性中耳炎等相關感染性疾病。本次監測肺炎鏈球菌在呼吸道標本中檢出率最高，非腦膜炎PNSP平均檢出率為31.2%，對紅霉素和克林霉素耐藥率最高（＞90%），其次為甲氧芐啶-磺胺甲唑（＞65%），都較成人報道高，未檢出萬古霉素和利奈唑胺耐藥株。腸球菌屬中，屎腸球菌對絕大多數測試抗菌藥物的耐藥率顯著高于糞腸球菌，未發現對萬古霉素和利奈唑胺的耐藥菌株。

大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌是本次檢出率排名前2位的革蘭陰性菌。6年間肺炎克雷伯菌產ESBL的平均檢出率高于大腸埃希菌產ESBL率。碳青霉烯類抗生素被認為是臨床治療革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線。隨著一系列碳青霉烯酶的出現，臨床分離的碳青霉烯類耐藥菌日益增多，并且這些病原菌常同時攜帶其他多種耐藥基因，幾乎對所有抗菌藥物耐藥，該類菌引起的感染有很高的病死率。我院細菌耐藥監測數據顯示：大腸埃希菌對碳青霉烯類仍保持較高的敏感率（耐藥率＜3%），但肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率呈逐年上升趨勢。本監測顯示，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）對亞胺培南耐藥率從2011年的3.1%上升至2016年的28.7%，與2005－2014年CHINET報道結果一致[10]，其升高原因考慮可能與患者的一般情況差、以往使用過抗菌藥物、入住ICU、實質臟器或血液移植、外科手術、導管和引流管留置等因素有關[11]。據文獻報道，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制主要是產碳青霉烯酶，其中成人CRKP主要以產KPC-2酶為主，兒童CRKP主要以金屬酶NDM-1為主[12-13]。同時深入研究發現我院CRKP以金屬酶NDM-1多見，主要在新生兒人群中播散流行[13]，針對此現象，需加強對重點病區的流行病學調查，采取積極有效的感控措施防止耐藥菌在病區流行引起大范圍擴散。

鮑曼不動桿菌是我院革蘭陰性桿菌中耐藥率最高的菌種，也是目前醫院感染面臨的最重要的問題。該菌對亞胺培南的耐藥率從2011年的38.3%上升至2016年的68.4%，對其他受試抗菌藥物的耐藥率6年間呈鋸齒形波動，提示可能存在該類菌株的克隆傳播。需采取有效措施防止其進一步擴散。但兒童患者銅綠假單胞菌的耐藥率變化不大，如對亞胺培南和美羅培南的耐藥率6年間分別為4.7%～18.8%和4.7%～19.4%。

流感嗜血桿菌為兒童社區獲得性肺炎的另一種重要病原菌。此次監測數據顯示β內酰胺酶檢出率在30%～60%，氨芐西林耐藥率33.7%～54.6%，且已出現β內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株（BLNAR）。文獻報道流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥的主要機制是產β內酰胺酶水解β內酰胺類抗生素，常見的β內酰胺酶有TEM-Ⅰ和ROB-Ⅰ型2種，其中90%以上為TEM-Ⅰ型[14]，BLNAR的耐藥機制是ftsI基因氨基酸位點突變引起青霉素結合蛋白PBP的結構改變使與氨芐西林等其他β內酰胺類抗生素的親和力降低，不能被β內酰胺酶抑制劑所抑制[15]。通過進一步對我院流感嗜血桿菌耐藥性和基因型分型的研究，表明我院呼吸道分離流感嗜血桿菌ftsI基因突變率高，以Ⅲ型為主，ftsI基因突變增加了流感嗜血桿菌對氨芐西林和頭孢呋辛的耐藥率[15]。

綜上所述，6年監測數據表明患兒不同標本中細菌的分布各有特點，多重耐藥菌株MRSA、CRKP、CRAB不斷增長，特別是CRKP的顯著增長不容忽視，需重視兒童耐藥菌的監測，采取積極有效的防控措施，及時阻斷耐藥菌株的播散和流行，增強醫護人員的衛生意識。