水稻種子特異性谷蛋白GluB1啟動子在水稻愈傷組織中驅動外源基因表達

趙艷?唐湧洲?史玉倩

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水稻種子特異性谷蛋白GluB1啟動子在水稻愈傷組織中驅動外源基因表達

趙艷*唐湧洲?史玉倩

(浙江工商大學 食品與生物工程學院, 杭州 310018;*通訊聯系人, E-mail: yanzhao9918@163.com)

【目的】水稻谷蛋白啟動子GluB1(GluB1 promoter，pGluB1)常用于外源基因在種子中特異性高效表達的研究，也是研究種子儲藏蛋白基因表達調控機制的模型。前人研究表明，pGluB1只在水稻胚乳中表達，而在根、莖、葉片、葉鞘、穎殼等組織中均無表達活性。研究的目的是為了克服種子特異表達啟動子篩選周期長的缺點。【方法】將由pGluB1驅動的霍亂毒素B亞單位和重組胰島素原組成的融合基因(a fusion gene of the cholera toxin B subunit and human proinsulin,)表達載體pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS經農桿菌介導法轉化水稻成熟胚愈傷組織。通過RT-PCR和蛋白質印跡雜交試驗檢測融合基因在水稻愈傷組織中的轉錄和翻譯表達。【結果】獲得的7個轉基因愈傷克隆中，有6個克隆的融合基因在轉錄水平上表達。選取其中4個克隆進一步進行蛋白質印跡雜交試驗檢測證實融合基因均在翻譯水平上表達,而且從分子量大小推斷融合蛋白包含的谷蛋白GluB1的N-端信號肽序列(24個氨基酸殘基)在所測的愈傷組織細胞中均被成功切除。【結論】水稻種子特異性啟動子pGluB1在愈傷組織中具有驅動外源基因表達活性，種子蛋白體亞細胞定位信號肽序列可在愈傷組織細胞中被切除。這為在愈傷組織細胞中快速檢測種子特異表達啟動子活性和探索愈傷組織中蛋白質的亞細胞分揀機制奠定了基礎。

谷蛋白B1啟動子；信號肽；水稻；成熟胚愈傷組織；表達活性

啟動子是RNA聚合酶識別并與之結合從而起始基因轉錄的一段DNA序列，通常位于基因上游。在錯綜復雜的基因表達調控網絡中，啟動子控制的基因轉錄起始是關鍵樞紐[1]。根據表達方式，啟動子分為組成型、時空特異型、誘導型三類，其中，時空特異型表達啟動子包括發育階段特異表達和器官組織特異表達兩種[2]。種子生物反應器是應用種子特異表達啟動子驅動重組蛋白基因在谷物種子中大量表達生產目標蛋白的新興生物技術。水稻作為主糧作物，由于種子產量大，基因轉化技術成熟，容易規模化種植且自花授粉特性，具有天然的生態安全優勢，很快發展為表達藥用重組蛋白和口服疫苗的優選種子生物反應器[3]。種子特異表達啟動子的篩選和克隆是構建種子生物反應器的重要環節。谷蛋白是水稻種子的主要儲藏蛋白，含量可達種子蛋白總量的80%，水稻谷蛋白分為GluA、GluB、GluC和GluD四個亞類，約由15個基因編碼[4]。研究表明，谷蛋白GluB1啟動子(GluB1 promoter，pGluB1) (1.3 kb和2.3 kb)是水稻胚乳特異性高效表達啟動子，在轉基因水稻根、莖、葉片、葉鞘、穎殼等組織均不表達[5-7]，也是水稻種子生物反應器生產重組藥用蛋白研究中的熱點啟動子[8-9]。如pGluB1驅動大豆球蛋白基因()在水稻中的高表達，其表達量可達種子蛋白總量的4%~5%[10]，而且與非轉基因對照相比，轉基因水稻種子除蛋白含量增加20%，水分含量有所降低外，其他營養成分及生理功效指標均無明顯變化，食用安全性好[11]。2.3 kb的pGluB1驅動人工合成雜交肽7 Crp基因轉化水稻后，每粒大米能獲得約60 μg重組7Crp蛋白[12]。然而，試驗周期長是谷物種子特異表達啟動子篩選的主要缺點，啟動子能否在種子中正常表達要等轉基因植株成熟結實后才能檢測，尋找快速鑒定種子特異啟動子的表達方法對種子生物反應器的構建具有突破性意義。

水稻GluB1的啟動子也是研究種子儲藏蛋白表達調控機制的重要模型[4,8]。前人研究一致認為pGluB1屬于胚乳特異性高效表達啟動子[5-7,10,12]，未見其在其他組織表達的有關報道。但某些種子特異性啟動子也能在花粉中表達，如Chesnokov等[13]報道煙草種子特異性未知蛋白(unknown seed protein，USP)基因和豆球蛋白B4(legumin B4，LegB4)基因的啟動子，在中波紅斑效應紫外線輻射誘導條件下，可驅動綠色熒光蛋白()報告基因在煙草花粉粒中表達。Russell等[14]發現種子特異表達的玉米淀粉粒結合淀粉合成酶基因和水稻ADPG焦磷酸化酶基因的啟動子能同時在玉米胚乳和花粉中特異表達。但迄今尚未見植物種子特異表達啟動子在愈傷組織中表達的有關報道。愈傷組織是植物細胞的一種特殊的脫分化狀態，其代謝較普通細胞旺盛，蛋白質和核酸合成更為迅速，并具有形成體細胞胚和完整植株的潛能。我們課題組將水稻pGluB1啟動子及其信號肽序列(GluB1 promoter and its signal peptide，pGluB1sig)驅動人工合成的霍亂毒素B亞基與人胰島素原的融合基因(cholera toxin B subunit fused with human proinsulin，)構建農桿菌表達載體并成功轉化水稻[15]。本研究通過RT-PCR、蛋白質印跡雜交試驗證明融合基因在水稻愈傷組織中也能成功表達，報道水稻種子特異啟動子pGluB1在水稻成熟胚愈傷組織中的表達活性，為應用愈傷組織快速篩選鑒定種子特異表達啟動子提供了新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻品種日本晴水稻種子由中國水稻研究所饋贈。含有載體pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN- NOS的農桿菌LBA4404由本實驗室構建保存。T-DNA區結構框架示于圖1，其中包括綠色熒光蛋白(modified green fluoresent protein, mGFP)報告基因表達框和潮霉素磷酸轉移酶(Hygromycin B phosphotransferase, hpt)抗性篩選標記基因表達框。

1.2 方法

1.2.1 農桿菌介導法轉化水稻愈傷組織

水稻成熟胚愈傷組織的誘導、繼代培養和農桿菌介導轉化參照文獻[16]。本研究選用NB為基本培養基，愈傷組織的誘導及繼代、篩選在28℃黑暗條件下進行。挑選繼代培養3~5 d的水稻胚性愈傷組織與含有載體pCAMBIA1302-pGluB1sig- CTBIN-NOS的農桿菌共培養3 d后，用無菌水沖洗6次，含有250 mg/L羧芐青霉素的無菌水浸泡殺菌1 h，無菌濾紙上吹干，轉移至篩選培養基(NB+2 mg/L 2,4-D+50 mg/L潮霉素+250 mg/L羧芐青霉素，pH 5.8)篩選兩輪，每輪14~20 d，挑選出抗性愈傷組織進行繼代擴培和基因表達檢測。

1.2.2 抗性愈傷組織的PCR鑒定和報告基因表達觀察

使用盧江揚等的方法[17]提取水稻愈傷組織基因組DNA，根據基因序列設計引物對(正向引物P1: 5′-TCTTCTCCTACACCGAGTCCCT-3′；反向引物P2:5′-TCCTATTACAGCTCGTCCTTGC-3′；擴增產物為567 bp片段，由上海生工生物工程有限公司合成)對轉基因愈傷組織克隆進行PCR鑒定。PCR擴增程序如下：95℃下預變性5 min；95℃下變性30 s，58℃下退火30 s，72℃下延伸45 s，30個循環；72℃下終延伸10 min，4℃下保存。

T BORDER(L)―左邊界; T BORDER(R)―右邊界; 35S―煙草花椰菜病毒35S啟動子; hpt―潮霉素B磷酸轉移酶基因; NOS―胭脂堿合成酶終止子; pGluB1―水稻 2.3 kb谷蛋白GluB1啟動子; signal―水稻谷蛋白GluB1信號肽序列; CTBIN―人工設計合成的胰島素原與霍亂毒素B亞單位融合基因，C端附加KDEL ER滯留信號基因序列; mGFP―修飾的綠色熒光蛋白基因。

Fig. 1. Sketch map of T-DNA of pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS vector.

使用DMI3000型熒光顯微鏡在藍色濾光片下觀察綠色熒光蛋白基因在水稻愈傷組織中的表達情況。

1.2.3 RT-PCR檢測轉基因水稻愈傷組織中基因表達

取約100 mg轉基因水稻愈傷組織，用Trizol法提取總RNA。根據序列采用Primer 5.0設計RT-PCR特異性引物(正向引物P3: 5′-CAACAA GACCCCGCACGC-3′；反向引物P4: 5′-GGAGCA GATGGAGGTGCAGC-3′)。以水稻作為內標設計特異引物(正向引物P5: 5′-CCGTGAGAA GATGACCCAG-3′；反向引物P6: 5′-GGCGAAACC CTCGTAGATGG-3′)。反轉錄實驗，gDNA去除和cDNA第1鏈合成按逆轉錄試劑盒(TOYOBO, Revertra Ace qPCR RTMaster Mix with gDNA Remover)說明書操作。以cDNA作為模板PCR分別擴增和，體系如下：Premix10 μL，cDNA 2 μL，正反引物各加1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序如下：95℃下預變性3 min；95℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸40 s，30個循環；72℃下終延伸10 min，4℃下保存。1%瓊脂糖凝膠電泳，拍照。

1.2.4 Western blot檢測轉基因水稻愈傷組織CTBIN蛋白表達

水稻愈傷組織可溶性總蛋白提取方法參照Jang等[18]，略有修改。選取幾個生長較好的轉基因水稻愈傷組織克隆0.1~0.2 g于研缽中，液氮迅速研磨成粉，加入500 μL蛋白質提取液(10 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，30 mmol/L NaCl，2% 巰基乙醇，2 mmol/L PMSF)，4℃下浸提1 h，離心得上清即為蛋白提取液，Bradford法[19]進行蛋白質含量的測定。SDS-PAGE電泳的分離膠為15%，濃縮膠5%，保證每泳道蛋白上樣量一致，均為20 μg。SDS-PAGE電泳結束后，用電轉移法轉移到PVDF膜，進行Western blot雜交檢測。一抗采用兔抗人胰島素原抗體(1∶500，鎮江博研生物科技有限公司)；二抗采用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶5000，Santa公司)，采用ECL顯色試劑盒(Invitrogen 公司)顯色。

2 結果與分析

2.1 抗性愈傷組織的篩選、繼代培養

經農桿菌侵染的水稻愈傷組織共培養后，轉移至含有50 mg/L潮霉素的篩選培養基中篩選后，部分愈傷組織褐化死亡，抗性愈傷組織從褐化愈傷組織中長出(圖2-A)。選取顏色淡黃，生長狀態較好的愈傷組織在篩選培養基中繼代培養，每兩周繼代一次(圖2-B)。

2.2 抗性愈傷組織PCR鑒定和報告基因gfp表達檢測

利用重組胰島素原基因的引物對獲得的水稻抗性愈傷組織克隆的基因組DNA進行PCR擴增，以質粒pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN- NOS為陽性對照，未轉化愈傷組織為陰性對照，進行PCR(圖3)。鑒定的7個轉基因愈傷克隆全部為陽性，獲得與預期片段大小相符的約567 bp目的基因片段，轉基因陽性率為100%。

圖2 篩選中的抗性愈傷組織(A)和繼代中的抗性轉基因愈傷組織(B)

Fig. 2. Resistant rice calli on screening medium(A) and resistant transgenic calli on subculture medium(B).

M?DL 2000 DNA 標記; P?質粒陽性對照; CK?非轉基因愈傷組織陰性對照; 1~7分別代表轉基因水稻愈傷不同克隆。

Fig. 3. PCR analysis ofgene in ricetransgenic callus clones.

圖4 綠色熒光蛋白基因gfp在水稻轉基因愈傷組織中表達的熒光顯微鏡觀察

Fig. 4. Fluorescence microscope detection of thegene expression in rice transgenic calli.

將抗性愈傷組織克隆在熒光顯微鏡下觀察，可見明顯綠色熒光(圖4)，說明口服胰島素原載體pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS確實成功轉化了水稻愈傷組織。

2.3 轉基因水稻愈傷組織CTBIN基因轉錄表達的RT-PCR鑒定

提取上述7個轉基因水稻愈傷克隆的總RNA，以水稻為內參基因進行反轉錄實驗，檢測基因的轉錄表達，結果見圖5。7個克隆中均擴增出了內參基因約為200 bp的條帶，說明RT-PCR實驗系統正常。有6個克隆擴增出了目的基因的300 bp預期片段，說明轉基因水稻愈傷組織細胞中的種子特異的pGluB1啟動子成功驅動了外源基因的轉錄表達。只有3號轉基因克隆的未檢測到轉錄表達，原因可能是該克隆中基因整合位點特殊或序列不完整影響了基因表達。

2.4 Western blot檢測轉基因水稻愈傷組織CTBIN基因的翻譯表達

以非轉基因水稻愈傷組織為對照，提取1、2、4、5號轉基因水稻愈傷組織克隆的細胞總蛋白，以兔抗人胰島素原抗體進行Western blot檢測，結果如圖6。檢測的4個轉基因水稻愈傷克隆均表達了特異性的目標蛋白條帶，分子量約25 kD，而對照中未出現雜交信號，表明種子特異性谷蛋白GluB1啟動子在水稻成熟胚愈傷組織中成功驅動了外源基因的表達。理論上，如果目標蛋白包括谷蛋白GluB1的N-端信號肽序列(24個氨基酸殘基)，分子量約為28 kD, 但檢測到的目標蛋白分子量在25 kD左右，相當于CTB-人胰島素原融合蛋白，由此推測融合蛋白中的N-端信號肽序列已被切除。

上圖為目的基因CTBIN擴增條帶，下圖為水稻內參基因β-actin擴增條帶。M?DL2000 DNA標記；CK?非轉基因愈傷克隆陰性對照；1~7代表轉基因水稻愈傷不同克隆。

Fig. 5. Detection of transcriptional expression ofgene in transgenic rice calli by RT-PCR.

CK―非轉基因愈傷克隆陰性對照；1, 2, 4, 5―不同轉基因愈傷克隆編號。

Fig. 6. Detection of translational expression ofgene in transgenic rice calli by Western blot.

3 討論

水稻作為基因組研究的模式生物，深入研究其基因表達的調控模式對理解植物的形態、發育和代謝調控等機理具有重要意義。pGluB1是近年來水稻種子生物反應器的研究熱點[6-12,20]，迄今未見關于pGluB1在植物種子以外組織中表達的報道。本研究結果證明，pGluB1啟動子能驅動外源基因在水稻成熟胚愈傷組織中轉錄和翻譯，而且融合蛋白包含的谷蛋白GluB1的N-端信號肽序列(24個氨基酸殘基)在愈傷組織細胞中也被切除。

影響植物啟動子表達的因素很多，所有基因表達調控都是通過細胞內的反式作用因子和啟動子上游各種順式作用元件的相互作用來實現的。本研究采用的2.3 kb pGluB1啟動子除了包含植物啟動子表達所必需的基本上游啟動子元件如 TATA-box (TATAAA)、核糖體結合位點(AGGAGG)外，還包含與種子特異表達相關的順式作用元件如AACA (AACAAAC)、GCN4(TGAGTCA)、(GTCAT)、ACGT、醇溶谷蛋白框(AAAG)、PROL(TGCAAAG)等基序。其中，AACA基序的作用是抑制種子特異性基因在胚乳以外的其他組織表達[21]，GCN4和其他幾個基序聯合控制基因的胚乳特異性表達活性和表達水平[22]。GCN4基序是啟動子種子特異性表達所必需的，屬于基本亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)轉錄因子家族成員及其同源蛋白的識別位點，水稻種子特異的bZIP蛋白RISBZ1與GCN4基序作用可使啟動子表達活性增加100倍以上[23]。而AACA基序被MYB蛋白識別，在種子以外的其他組織作為抑制下游基因表達的負調控元件。OSMYB5蛋白在水稻多種組織中表達，但在種子以外的組織中，OSMYB5蛋白與AACA基序結合從而抑制水稻谷蛋白B1基因的表達[24]。然而，AACA基序與CaMV 35S啟動子核心序列融合成人工啟動子驅動構建報告基因載體，并與基因表達載體共同轉化水稻胚盾片愈傷組織來源的原生質體并進行瞬時表達測試，發現OSMYB5未能對AACA基序產生作用[24]，說明在水稻種子和愈傷組織來源的原生質體中反式作用因子與順式作用元件的相互識別和作用存在差異。本研究中pGluB1成功驅動外源基因在水稻成熟胚愈傷組織中表達的原因，一方面可能是在愈傷組織中，某些反式作用因子如MYB蛋白無法與負調控基序如AACA發生作用，從而解除了對下游基因的表達抑制。另一方面，植物愈傷組織形成的體細胞胚與合子胚的發育大體相似，只是在細胞分裂方式、排列方式及形態特征上存在一些差異[25]，推測愈傷組織細胞的基因表達模式和種子基因表達模式可能具有一定的相似性。Chen等[4]報道水稻CCCH型鋅指蛋白OsGZF1在原生質體瞬時表達時，降低pGluB1啟動子的表達活性的調控機制與其在轉基因水稻種子中的調節機制確實存在一致性。因此，種子中特異表達的某些反式作用因子如RISBZ1也可能在愈傷組織中表達，本研究中可能這類反式作用因子通過與pGluB1啟動子元件作用從而參與了基因的表達激活。由于水稻種子儲藏蛋白的特異啟動子元件在其他禾谷類作物如玉米、小麥種子儲藏蛋白啟動子序列中具有保守性，因而調控機制也相似[4,26]。本研究發現為探索植物種子特異啟動子在愈傷組織中的表達活性及其機制提供了基礎線索,也為應用愈傷組織初步快速篩選鑒定種子特異表達啟動子提供了可能。

亞細胞定位靶向表達是植物生物反應器中提高重組蛋白表達量的有效手段。Jang等[18]報道，水稻葉綠體靶向運輸信號肽序列(Target peptide, Tp)能介導外源GFP重組蛋白在水稻愈傷組織的非綠質體中高水平積累并正確加工，將N-端Tp序列切除。本研究的Western blot檢測結果表明(圖6)，從分子量上看，pGluB1驅動融合基因在愈傷組織中表達時，融合蛋白N-端融合的谷蛋白GluB1信號肽序列(GluB1 signal peptide, GSp)能被成功切除。在水稻種子胚乳細胞中，谷蛋白前體在內質網腔合成，然后通過內膜系統分揀輸送到蛋白儲存囊泡，形成PB-I和PB-II，谷蛋白的信號肽序列在起源于高爾基器的PB-II中由特異的天冬酰胺內肽酶切除。由pGluB1驅動并在N-端添加GSp和C-端添加KDEL內質網滯留信號的重組7Crp多肽在水稻種子特異表達時，卻主要在起源于內質網的PB-I中大量積累[20]。在成熟胚愈傷組織中表達的重組CTBIN蛋白是否也被分揀輸送到囊泡中儲存積累？其N-端GSp的加工切除機制是否與種子中相似？植物愈傷組織細胞內是否可形成類似于種子蛋白體的重組蛋白亞細胞儲存機構？這些基本科學問題的探尋有望為植物愈傷組織細胞生物反應器的研究和應用開辟新思路，本研究結果為此提供了重要線索。

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Rice Seed-specific Glutenin GluB1 Promoter Drives Exogenous Gene Expression in Rice Callus

ZHAO Yan*,TANG Yongzhou, SHI Yuqian

(,,,;Corresponding author,:)

【Objective】The promoter of rice glutelin B1(pGluB1) has been intensively used to study high seed-special expression of exotic genes, and as a model to understand regulation mechanism of seed-storage protein genes. Former researchers reported that pGluB1expressed only in rice seed endosperm with no expression activity in other tissues such as root, stem, leaf, sheath and glume etc. The present study is aiming to overcome the shortcoming of time consuming for screening of seed-special expression promoters.【Methods】The expression vector pCAMBIA1302-pGluB1sig- CTBIN-NOS, in which a fusion gene of the cholera toxin B subunit and human proinsulin () was driven by the 2.3 kb promoter sequence of rice glutelin GluB1 with its signal peptide (), was transformed into the rice calli from mature embryo via-mediated method. The expression of fusion geneat both transcription and translation level was tested by RT-PCR and Western-blotting assay.【Results】Among the seven transgenic calli clones, six clones of the fusion genewere expressed at transcription level. The selected four clones subjected to Western-blotting assay were all fatherly verified in their expression at translation level. Additionally, according to the molecular weight, we speculated that the signal peptide (24 aa) of GluB1 at N-terminus of the fusion protein CTBIN has been excised successfully from callus cells of all the test clones.【Conclusion】The rice seed-specific expression promoter pGluB1 can drive an exotic gene expression in callus, and the seed protein body subcellular-targeted signal peptide could be excised from callus cells. The results lay a foundation ofthe quick detection of expression activity of plant seed-specific expression promoters in callus and exploiting the mechanism of protein subcellular sorting selection in callus cells.

glutelin B1 promoter; signal peptide; rice; mature embryo calli; expression activity

10.16819/j.1001-7216.2018.8036

Q755；S511.01

A

1001-7216(2019)01-0028-07

2018-03-28；

2018-07-04。

國家自然科學基金資助項目(31772100)；浙江省一流學科建設經費資助項目(食品科學與工程1110JYN6517001G)。