骨橋蛋白對小鼠膽囊結(jié)石形成的作用及其機(jī)制探討

郭滿，張浩，李偉漢

（鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院 乳腺甲狀腺外科，河南 南陽 473009）

膽囊結(jié)石是常見的消化系統(tǒng)疾病，隨著人們生活方式的改變，膽囊結(jié)石尤其膽固醇結(jié)石發(fā)病率呈不斷升高趨勢[1]。人體膽固醇代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)失衡可導(dǎo)致膽囊膽固醇結(jié)石患病率升高[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白（Osteopontin, OPN）可以影響肝臟膽固醇的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及小腸膽固醇吸收，從而影響膽固醇結(jié)石的形成[3-4]。膽固醇結(jié)石形成是一個(gè)多步驟、多環(huán)節(jié)的代謝疾病，膽囊的病理生理狀態(tài)對膽結(jié)石的形成亦有至關(guān)重要的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)研究OPN敲除對膽囊膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，以期進(jìn)一步理清OPN調(diào)節(jié)膽囊膽固醇結(jié)石形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本采集

7只C57BL/6J小鼠購于復(fù)旦大學(xué)作為對照組，7只相同背景OPN敲除小鼠購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室作為敲除組。室溫（22±2）?C、濕度（60±10）%環(huán)境飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。兩組小鼠相同環(huán)境分籠飼養(yǎng)，敲除組小鼠喂養(yǎng)致石飼料（普通小鼠飼料添加15%脂肪，2%膽固醇，0.5%膽酸），投食3或4次/d，不限飲水，飼料由上海史萊克公司提供。喂養(yǎng)8周后，收集膽囊膽汁，肉眼及偏光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察膽汁成石及膽固醇結(jié)晶情況。剩余膽汁4℃、15 000 r/min離心15 min，加入膽汁保存液，置于-70℃冷凍保存?zhèn)溆?。收集膽囊組織液氮速凍用于蛋白質(zhì)和RNA提取。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 膽結(jié)石形成分析與膽汁生化檢測

膽固醇結(jié)石定義為膽囊內(nèi)肉眼可見。膽固醇晶體定義為偏光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）可見。膽汁膽固醇、膽汁酸和三酰甘油含量測定按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，膽固醇過飽和指數(shù)（cholesterol saturation index, CSI）按照Carey表格計(jì)算。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）測定ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子G亞家族成員5/8（ATP binding cassette transporter sub-family G member 5/8, ABCG5/ABCG8）及肝臟X受體（liver X receptor, LXR）在膽囊組織中的表達(dá)。按Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）說明書提取組織標(biāo)本的RNA。mRNA測定按qRT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書進(jìn)行，檢測采用ABI 7900HT快速qRT-PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，60℃變性 30 s，72℃退火 45 s，72℃延伸 10 min，共40個(gè)循環(huán)。閾值循環(huán)（Ct）為在該熒光通過的固定閾值的分?jǐn)?shù)循環(huán)數(shù)，使用2-ΔΔCT法，以GAPDH為對照，計(jì)算相對表達(dá)量。PCR引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 PCR引物序列

1.4 Western blotting檢測

采用蛋白提取試劑盒提取膽囊組織總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度。參照試劑盒說明書進(jìn)行Western blotting檢測?？贵w稀釋度如下：抗ABCG5（1 ∶ 1 000），抗 ABCG8（1 ∶ 1 000），抗 LXR（1∶1 000），抗β-actin （1∶500）。Western blotting檢測結(jié)果用化學(xué)發(fā)光法暴露于照相膠片。免疫反應(yīng)帶采用Image J軟件參照β-actin進(jìn)行量化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽囊成石情況

致石飲食飼養(yǎng)8周后，對照組小鼠膽囊成石率為85.71%（6/7），敲除組為14.29%（1/7），經(jīng)Fisher確切概率法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029）。采用偏光顯微鏡觀察敲除組小鼠膽汁清亮，而對照組小鼠膽汁渾濁且存在大量膽固醇結(jié)晶。見圖1。

2.2 膽囊炎癥情況

致石飲食飼養(yǎng)8周后，對照組小鼠膽囊黏膜增厚且局部有大量炎癥細(xì)胞浸潤，而敲除組小鼠黏膜未見上述表現(xiàn)。見圖2。

圖1 小鼠膽汁膽固醇結(jié)晶及膽固醇結(jié)石

圖2 兩組小鼠膽囊黏膜 （HE×100）

2.3 OPN敲除改變膽汁膽固醇含量和CSI指數(shù)

實(shí)驗(yàn)前兩組小鼠膽囊體積、膽汁膽固醇、磷脂含量、膽汁酸含量及CSI比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。喂食致石飲食8周后，兩組小鼠膽囊體積、膽汁磷脂含量和膽汁酸含量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組小鼠膽汁膽固醇含量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），敲除組較對照組低。兩組小鼠CSI比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），敲除組較對照組低。見表2。

表2 兩組小鼠膽囊體積，膽汁膽固醇、磷脂、膽汁酸含量及CSI比較 （n =7，±s）

表2 兩組小鼠膽囊體積，膽汁膽固醇、磷脂、膽汁酸含量及CSI比較 （n =7，±s）

注：t1、P1為兩組實(shí)驗(yàn)前比較，t2、P2為兩組實(shí)驗(yàn)后比較

組別膽囊體積/μl膽汁膽固醇含量/（mmol/L）磷脂含量/（mmol/L）膽汁酸含量/（mmol/L）CSI敲除組實(shí)驗(yàn)前 23.2±5.01 2.75±0.77 24.19±2.75 56.68±8.34 0.47±0.09實(shí)驗(yàn)后 26.9±7.62 5.35±1.08 26.31±2.21 84.07±5.97 0.55±0.07對照組實(shí)驗(yàn)前 24.6±7.45 2.31±0.46 23.76±2.21 61.37-7.63 0.45±0.10實(shí)驗(yàn)后 23.5-5.31 9.34+0.85 28.40±3.49 77.81±8.21 1.09±0.12 t1值 0.472 1.283 0.323 1.098 0.409 P1值 0.645 0.225 0.752 0.294 0.691 t2值 0.964 7.134 1.563 1.695 8.621 P2值 0.354 0.001 0.144 0.113 0.002

2.4 OPN敲除對膽囊ABCG5、ABCG8及LXR表達(dá)的影響

2.4.1 mRNA 實(shí)驗(yàn)前兩組小鼠ABCG5、ABCG8及LXR mRNA表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。致石飲食飼養(yǎng)后敲除組和對照組小鼠膽囊ABCG5 mRNA相對表達(dá)量分別為（0.47±0.08）和（1.01±0.07），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.172，P=0.001）。敲除組和對照組小鼠膽囊ABCG8 mRNA相對表達(dá)量分別為（0.53±0.07）和（1.04±0.11），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.714，P=0.001）。敲除組和對照組小鼠膽囊LXR mRNA相對表達(dá)量分別為（0.49±0.08）和（1.01±0.06），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.473，P=0.002）。見圖3。

2.4.2 蛋白 致石飲食飼養(yǎng)后敲除組和對照組小鼠膽囊ABCG5蛋白相對表達(dá)量分別為（0.51±0.06）和（1.03±0.08），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.838，P=0.002）。敲除組和對照組小鼠膽囊ABCG8蛋白相對表達(dá)量分別為（0.48±0.07）和（1.01±0.10），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.913，P=0.001）。敲除組和對照組小鼠膽囊LXR蛋白相對表達(dá)量分別為（0.58±0.09）和（0.99±0.07），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.127，P=0.003）。見圖4。

圖3 實(shí)驗(yàn)前后兩組小鼠ABCG5、ABCG8和LXR mRNA表達(dá)水平比較 （n =7，±s）

圖4 兩組小鼠實(shí)驗(yàn)前后ABCG5、ABCG8和LXR蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，OPN敲除小鼠具有更低的膽汁膽固醇含量，更低的飲食誘發(fā)膽結(jié)石形成率。本研究還發(fā)現(xiàn)，致石飲食喂養(yǎng)8周后兩組小鼠膽囊容積無差異，表明OPN敲除并未對小鼠膽囊運(yùn)動(dòng)、排空功能產(chǎn)生影響。生化分析顯示，OPN敲除小鼠膽汁中膽固醇含量較C57BL/6J小鼠降低，而膽汁酸和磷脂含量無明顯變化，使敲除組小鼠膽囊膽汁具有更低的CSI，表明OPN敲除對小鼠膽囊結(jié)石形成的保護(hù)作用來自于降低了膽汁中膽固醇的含量。

膽固醇在機(jī)體內(nèi)的代謝是一個(gè)多器官、多步驟的過程。ABCG5和ABCG8是三磷酸腺苷結(jié)合盒（ABC）G亞家族中超家族成員，兩者在細(xì)胞內(nèi)以異二聚體方式結(jié)合，組成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與膽固醇代謝，調(diào)節(jié)膽囊膽固醇結(jié)石形成[5]。肝臟組織過表達(dá)ABCG5和ABCG8可導(dǎo)致肝臟膽汁中膽固醇過飽和[5]。膽囊膽固醇結(jié)石患者膽囊組織中也存在ABCG5和ABCG8過表達(dá)的現(xiàn)象[6]。研究發(fā)現(xiàn)，膽囊組織表達(dá)ABCG5和ABCG8的功能是將膽固醇從膽囊上皮細(xì)胞排泄至膽囊腔內(nèi)，起到提高和維持膽汁膽固醇濃度的作用[7-8]。因此，肝臟膽固醇代謝失衡是導(dǎo)致膽汁膽固醇過飽和的起始條件，而膽囊組織膽固醇代謝失衡，則使膽囊膽汁中過飽和的膽固醇得以維持和繼續(xù)，并最終促使膽囊中膽固醇的析出、結(jié)晶，以至最終膽囊膽固醇結(jié)石的形成。OPN參與膽固醇結(jié)石形成的調(diào)節(jié)，然而確切機(jī)制仍不明確。NUNEZ-GARCIA等[9]研究發(fā)現(xiàn)，OPN敲除小鼠體內(nèi)的膽固醇代謝酶CYP7A1表達(dá)升高，而且體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OPN對肝細(xì)胞內(nèi)CYP7A1的抑制作用是通過FAK-Akt信號通路實(shí)現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)，OPN敲除小鼠較對照組具有更低的膽囊ABCG5/ABCG8蛋白和mRNA表達(dá)水平，而膽囊組織中ABCG5/ABCG8的表達(dá)減少導(dǎo)致膽囊細(xì)胞向膽汁中排泄膽固醇減少。LXR是核受體家族的成員，對機(jī)體膽固醇代謝有重要調(diào)節(jié)作用[10]。在飲食誘導(dǎo)膽固醇結(jié)石的研究中發(fā)現(xiàn)，LXR對ABCG5、ABCG8和CYP7A1等膽固醇代謝關(guān)鍵因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，OPN敲除小鼠膽囊組織LXR表達(dá)水平較對照組降低，表明OPN可能通過作用于LXR從而調(diào)節(jié)ABCG5/ABCG8的表達(dá)。LIMA-CABELLO等[13]研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝組織中存在LXR、OPN及炎癥調(diào)節(jié)因子TNF-α和IL-6等過度表達(dá)。仝莎等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過調(diào)節(jié)LXR啟動(dòng)子活性，從而抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常積聚。本研究對小鼠膽囊進(jìn)行組織學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPN敲除小鼠較對照組膽囊黏膜炎癥較輕，炎細(xì)胞浸潤較少，這提示OPN下調(diào)可以減輕膽囊局部炎癥。

本研究對OPN調(diào)節(jié)膽固醇代謝，影響膽固醇結(jié)石形成的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討，發(fā)現(xiàn)OPN通過減輕膽囊組織炎癥反應(yīng)，減少LXR表達(dá)，減少膽囊ABCG5、ABCG8的表達(dá)，降低膽囊膽汁中膽固醇濃度，最終降低膽結(jié)石形成率。