LncRNA-ATB在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制探討*

李柏森，姜鶴群，文敏，易紅梅，李濤

[1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 瀘州 646099；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 成都 610500；3.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院(四川省癌癥防治中心)，四川成都 610041；4.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 胸心外科，四川 成都 610500]

約80%肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]，其預(yù)后差，總體生存率＜20%[2]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NSCLC死亡的主要原因[3]。因此，深入闡明其發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制有巨大的現(xiàn)實(shí)意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA activated by transforming growth factor β, LncRNA-ATB）是一類轉(zhuǎn)錄本＞200 nt的幾乎不具有蛋白編碼能力的RNA[4]。近年來(lái)，許多LncRNA被證實(shí)在NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。然而，LncRNA-ATB在NSCLC中的表達(dá)及功能尚未充分闡明。本研究擬探索LncRNA-ATB在NSCLC中的表達(dá)及其功能。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC和正常支氣管上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cells, HBEC）選取2012年3月7日—2015年5月8日在四川省腫瘤醫(yī)院就診的患者。NSCLC分為A549和HCI-H23細(xì)胞。用Trizol（美國(guó)Sigma公司）提取RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，qRT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，Transwell小室（美國(guó)Millipore公司），基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司），螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 將細(xì)胞鋪6孔板培養(yǎng)過(guò)夜至匯合度為80%，每孔加入1 ml Trizol裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入75%乙醇1 ml，14℃、12 000 r/min離心5 min。所得沉淀加入20μl去離子水，即為所需RNA。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 將 1μl RNA，2μl 5× PrimeScript RT Master，7μl去離子水輕柔混勻后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：37℃15 min，85℃5 s，4℃儲(chǔ)存。

1.2.3 qRT-PCR 總反應(yīng)體系25μl，具體如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5μl，正義鏈反義鏈引物各1μl，實(shí)時(shí)定量產(chǎn)物2μl，去離子水8.5μl。PCR反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后樣品保存于4℃。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算，LncRNA-ATB/microRNA-141（miR-141）相對(duì)表達(dá)量=2-（CTLncRNA-ATB/miR-141-CTU6）待測(cè)樣本-（CTLncRNA-ATB/miR-141-CTU6）校準(zhǔn)樣本。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 在 Transwell下室中加入600μl含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)采用預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的Milipore小室，細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)采用Milipore小室），上室中加入200μl約2×105個(gè)細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄上室液體，小心取出小室，濕棉簽去除未穿過(guò)膜的細(xì)胞。甲醇固定2 min，結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗滌，切下小室膜，封片。顯微鏡200倍視野下統(tǒng)計(jì)隨機(jī)10個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，拍照并繪制統(tǒng)計(jì)圖。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將NSCLC細(xì)胞鋪板，孵育過(guò)夜至細(xì)胞融合率達(dá)100%。用1 ml槍頭均勻地在細(xì)胞培養(yǎng)孔中劃痕，劃痕后用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入不含血清的培養(yǎng)基，拍照，此時(shí)細(xì)胞間距離為0 h距離。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再次拍照，此時(shí)細(xì)胞間距離為24 h距離。細(xì)胞遷移距離為2次細(xì)胞間距離之差再除以2。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜至匯合度達(dá)70%后，共轉(zhuǎn)染miR-141 mimics/miR-141 NC和pmiR-GLO-WT質(zhì)粒。裂解細(xì)胞后，取10μl樣品加入100μl熒光素酶檢測(cè)試劑，上機(jī)測(cè)定熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，方差分析后的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA-ATB在NSCLC和HBEC細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，LncRNA-ATB在HBEC細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為（1.000±0.050），在NSCLC的A549細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量為（4.319±0.158），在NSCLC的NCI-H23細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量為（4.753±0.031）。經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.417，P=0.011）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，NSCLC的A549和NCI-H23細(xì)胞中LncRNA-ATB表達(dá)水平高于HBEC細(xì)胞（t=5.435和6.416，P=0.016和0.014）。見圖1。

圖1 NSCLC和HBEC細(xì)胞中LncRNA-ATB的表達(dá)水平比較 （±s）

本研究合成特異性沉默LncRNA-ATB表達(dá)的shRNA，qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細(xì)胞中LncRNA-ATB的相對(duì)表達(dá)量均為（1.000±0.050）；轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細(xì)胞中LncRNA-ATB的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.228±0.027）和（0.332±0.019），經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組間LncRNA-ATB表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A549：t=5.731，P=0.021；NCI-H23：t=4.135，P=0.029）。LncRNA-ATB shRNA 可有效地沉默NSCLC細(xì)胞中LncRNA-ATB的表達(dá)（見圖2）。

2.2 LncRNA-ATB與NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系

轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)轉(zhuǎn)移細(xì)胞率為（100.0±5.0）%；轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)轉(zhuǎn)移細(xì)胞率為（25.3±3.2）%和（30.9±3.8）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A549：t=4.332，P=0.033；NCI-H23：t=3.451，P=0.037），沉默 Lnc-ATB可抑制NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。見圖3、4。

圖2 轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細(xì)胞中LncRNA-ATB的表達(dá)水平比較 （±s）

圖3 LncRNA-ATB促進(jìn)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移 （×200）

圖4 轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)轉(zhuǎn)移細(xì)胞率比較 （±s）

2.3 LncRNA-ATB與NSCLC細(xì)胞侵襲能力的關(guān)系

轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)侵襲細(xì)胞率為（100.0±5.0）%；轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)侵襲細(xì)胞率為（20.8±2.2）%和（24.9±1.7）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A549：t=5.482，P=0.017；NCI-H23：t=4.513，P=0.021），沉默 Lnc-ATB可抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲能力。見圖5、6。

圖5 LncRNA-ATB促進(jìn)NSCLC細(xì)胞侵襲 （×200）

圖6 轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)侵襲細(xì)胞率比較 （±s）

2.4 LncRNA-ATB與NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移距離的關(guān)系

轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)轉(zhuǎn)移距離均為（1.000±0.050）μm；轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)轉(zhuǎn)移距離為（0.423±0.024）和（0.381±0.029）μm，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A549：t=2.317，P=0.042，NCI-H23：t=2.726，P=0.039），沉默 Lnc-ATB可縮短N(yùn)SCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移距離。見圖7、8。

2.5 LncRNA-ATB在NSCLC細(xì)胞中吸附miR-141

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LncRNA-ATB存在miR-141結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-141 NC和miR-141 mimics的pmirGLOLncRNA-ATB相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（1.000±0.050）和（0.346±0.029），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.817，P=0.037），miR-141 mimics可特異性地與pmirGLO-LncRNA-ATB結(jié)合，并降低其熒光強(qiáng)度。見圖9。

圖7 LncRNA-ATB延長(zhǎng)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移距離 （×100）

圖8 轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細(xì)胞的相對(duì)轉(zhuǎn)移距離比較 （±s）

圖9 兩組相對(duì)熒光強(qiáng)度比較 （±s）

2.6 LncRNA-ATB在NSCLC細(xì)胞中下調(diào)miR-141的表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR-141 NC的A549和NCI-H23細(xì)胞中LncRNA-ATB的相對(duì)表達(dá)量均為（1.000±0.050）；轉(zhuǎn)染miR-141 mimics的A549和NCI-H23細(xì)胞中LncRNA-ATB的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.032±0.019）和（0.983±0.029），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A549：t=0.618，P=0.295；NCI-H23：t=0.561，P=0.332），轉(zhuǎn)染miR-141 mimics不能降低NSCLC細(xì)胞中LncRNA-ATB的表達(dá)水平（見圖10）。轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細(xì)胞中miR-141的相對(duì)表達(dá)水平均為（1.000±0.050）；轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細(xì)胞中miR-141的相對(duì)表達(dá)水平為（3.517±0.132）和（2.771±0.216），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A549：t=5.321，P=0.009；NCI-H23：t=4.316，P=0.015），沉默NSCLC細(xì)胞中LnRNA-ATB的表達(dá)可促進(jìn)miR-141的表達(dá)（見圖11）。

圖10 轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細(xì)胞中LncRNA-ATB的表達(dá)水平比較 （±s）

圖11 轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細(xì)胞中miR-141的表達(dá)水平比較 （±s）

3 討論

LncRNA在多種腫瘤中異常表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。LncRNA-ATB位于14號(hào)染色體（ENST00000493038），在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，與肝細(xì)胞癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)[7]。更為重要的是，多項(xiàng)研究表明lncRNAATB在胃癌[8]、結(jié)腸癌[9]、乳腺癌[10]及甲狀腺乳頭狀癌[11]等多種腫瘤中異常高表達(dá)，并與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。最新研究顯示，LncRNA-ATB在NSCLC組織中的表達(dá)異常升高，并與NSCLC患者不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，LncRNA-ATB在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平高于HBEC細(xì)胞。沉默NSCLC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-ATB的表達(dá)后，NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移能力受抑制，提示lncRNA-ATB可能在NSCLC細(xì)胞中扮演抑癌基因的角色。

值得注意的是，一些IncRNAs可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNAs, ceRNA），通過(guò)與miRNA特異性地結(jié)合而調(diào)控其靶基因。研究顯示，LncRNA-HOTAIR可通過(guò)與miR-331-3p結(jié)合而調(diào)控HER2的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[13]。LncRNAARSR可作為miR-34和miR-449的ceRNA，促進(jìn)AXL和c-MET的表達(dá)，從而促進(jìn)腎細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)舒尼替尼耐藥[14]。在肝細(xì)胞癌中，LncRNA-ATB可作為miR-200家族的ceRNA，調(diào)控ZEB1和ZEB2的表達(dá)[7]。本研究結(jié)果顯示，LncRNA-ATB可與miR-141特異性結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)，提示LncRNA-ATB在NSCLC細(xì)胞中可能作為miR-141的ceRNA，調(diào)控NSCLC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

miR-141屬于miR-200家族。研究顯示，miR-200家族與腫瘤干細(xì)胞形成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)系密切[15]。在miR-200家族中，miR-200bc/429和miR-200a/141簇在序列上有高度同源性[16]。多項(xiàng)研究顯示，miR-200/141可抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、NSCLC、女性生殖系統(tǒng)腫瘤和腎細(xì)胞癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖及耐藥[17-19]。更為重要的是研究顯示，在胃癌中LncRNA-ATB可與miR-141特異性結(jié)合，并降低其表達(dá)水平[20]。本研究結(jié)果顯示，LncRNA-ATB在NSCLC細(xì)胞中可特異性結(jié)合miR-141，并降低其表達(dá)水平，與既往研究結(jié)果一致。此外，本研究結(jié)果顯示，LncRNA-ATB可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。結(jié)合既往文獻(xiàn)，筆者推測(cè)LncRNA-ATB可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與miR-141結(jié)合并促進(jìn)其降解，而解除miR-141對(duì)下游靶基因的抑制，從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。值得注意的是LncRNA-ATB在乳腺癌[10]、腎癌[14]、肝癌[7]等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并可通過(guò)上調(diào)ZEB1、c-MET等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此LncRNA-ATB吸附miR-141僅為其促進(jìn)NSCLC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，更為復(fù)雜的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)NSCLC和HBEC細(xì)胞中LncRNA-ATB的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)LncRNA-ATB在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平高于HBEC細(xì)胞。沉默NSCLC細(xì)胞中LncRNA-ATB的表達(dá)后，NSCLC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低。研究結(jié)果顯示，LncRNA-ATB在NSCLC細(xì)胞中可吸附并下調(diào)miR-141的表達(dá)。本研究進(jìn)一步明確NSCLC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的NSCLC靶向治療靶點(diǎn)。