巖藻糖基轉移酶的研究進展

孫 玥,王曉非

(中國醫科大學附屬盛京醫院風濕免疫科，沈陽110022)

細胞表面糖結合物在細胞黏附、細胞分化、免疫應答、受精、病毒和細菌感染以及腫瘤進展等多種生理病理過程中發揮重要作用。含巖藻糖的多聚糖對廣泛的細胞事件至關重要。白細胞募集和滾動過程中，白細胞表面表達唾液酸化的路易斯寡糖x(sialyl lewis x，sLex)抗原可介導內皮細胞表面對選擇素的識別[1-2]。識別過程的順利完成依賴于對應巖藻糖基轉移酶(fucosyltransferase，FucT)的加工修飾，其活性的異常表達常與免疫系統疾病密切相關。當精子與卵細胞的細胞外基質結合時，人類受精開始。sLex是人類精子與卵子結合的主要碳水化合物配體，是卵母細胞表面最豐富的糖表位[3]。許多子宮內膜和胚胎的細胞表面寡糖被發現，包括sLex，非唾液酸化的路易斯x(lewis x，Lex)抗原和非唾液酸化的路易斯y(lewis y，Ley)抗原。α-2，3-唾液酸轉移酶和α-1，3-FucT依次催化sLex生物合成的最后兩步。sLex異常表達和FucT活性增強在許多腫瘤中存在，且可能參與腫瘤轉移過程[4-6]。由此可見，FucT抑制劑可作為潛在的抗炎、抗腫瘤藥物[7]。現就FucT的分類、組織分布以及與相關疾病關系等方面的研究進展做一綜述。

1 FucT的分類及組織分布

人類共有11種FucT，根據酶反應中形成的糖苷鍵的類型不同，分為α-1，2-FucT、α-1，3-FucT、α-1，4-FucT、α-1，6-FucT和o-FucT。人類Fut1基因和Fut2基因編碼α-1，2-FucT(分別表示FucT-Ⅰ和FucT-Ⅱ)，通過α-1，2-連接到N-乙酰乳糖胺的末端半乳糖催化巖藻糖的轉移。Fut 3～Fut 7和Fut 9基因編碼6個α-1，3-FucT(FucT-Ⅲ、FucT-Ⅳ、FucT-Ⅴ、FucT-Ⅵ、FucT-Ⅶ和FucT-Ⅸ)，負責路易斯抗原合成的最后一步，包括Lex、Ley、非唾液酸化的路易斯a抗原(lewis a，Lea)、非唾液酸化的路易斯b抗原(lewis b，Leb)、sLex和唾液酸化的路易斯a抗原(sialyl Lewis a，sLea)。FucT-Ⅷ由Fut8基因編碼，是唯一負責通過N-多糖核心結構上的α-1，6-鏈將L-巖藻糖添加到N-乙酰葡萄糖胺結構中的FucT。各類FucT組織分布是FucT-Ⅰ：紅細胞膜、血管內皮；FucT-Ⅱ：上皮細胞、體液；FucT-Ⅲ：母乳、腎臟、結腸；FucT-Ⅳ：白細胞、大腦、髓系細胞；FucT-Ⅴ：血漿、母乳、肝臟；FucT-Ⅵ：血漿、腎臟、肝臟、結腸；FucT-Ⅶ：白細胞、高內皮靜脈；FucT-Ⅷ：肝臟、大腦、胎盤、肺、胃；FucT-Ⅸ：大腦、胃、脾[8]。

2 FucT與腫瘤

腫瘤的特征是非正常細胞生長、侵襲或擴散到身體其他組織。腫瘤細胞糖基化異常被認為是腫瘤發病機制的普遍特征，常常顯示非正常糖蛋白或不同碳水化合物表位的差異表達。增加的巖藻糖基化和唾液酸化以及異常的O-聚糖是惡性細胞轉化的公認特征。巖藻糖基化表位的過度表達[如Ⅰ型(H1、Lea、Leb和sLea)和Ⅱ型(H2、Lex、Ley和sLex)]經常發生在腫瘤細胞表面，主要是相關FucT表達上調所致[9]。以上這些改變對腫瘤(細胞-細胞黏附、細胞-基質相互作用、細胞信號轉導、代謝、血管生成和免疫調節)有很大影響，最終導致癌癥的進展和轉移。Li等[10]提出，Fut3、Fut6或Fut7的過表達可恢復E選擇素配體，使小鼠前列腺癌細胞在電子選擇功能的微管中滾動和黏附，類似于骨髓血管中循環的前列腺癌細胞；心內注射FucT轉導小鼠前列腺癌細胞表達的熒光素酶后，Fut6介導的細胞能夠誘導小鼠骨轉移，巖藻糖模擬物對Fut6的抑制作用顯著降低骨轉移；比較臨床標本中Fut3、Fut6和Fut7基因的表達發現，Fut6在前列腺癌遠處轉移中的表達顯著上調，它是前列腺癌細胞向骨髓轉運的關鍵介質，可作為臨床前期試驗中降低前列腺癌骨轉移的有效藥物靶點。

Wang等[11]發現，sLex是原發性肝癌(primary carcinoma of liver，PLC)中最高表達的路易斯抗原，特別是低分化和轉移情況下。用Northern雜交法測量PLC中增加的路易斯抗原的酶基礎發現，PLC中Fut3和Fut6的信使RNA(messenger RNA，mRNA)水平明顯高于鄰近組織，在癌細胞血栓形成患者的門靜脈癌癥組織中更明顯。Guo等[12]的研究發現，人肝細胞癌組織中Fut6和sLex的表達增加，Fut6在人肝細胞癌細胞生長中扮演重要角色，可調節磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路。Fut4、Fut7和sLex與肺癌預后不良相關，Fut7的過表達可獲得人肺腺癌的肺定植表型[13-14]。Fut3、Fut6和Fut7在骨轉移性前列腺癌和肝轉移性前列腺癌細胞中的表達明顯增高，導致sLex和E選擇素配體的合成。Fut3表達升高通過E-選擇素無關事件促進細胞在骨髓中的遷移和滯留。α-1，6-巖藻糖基化在肝臟中非常豐富，而Fut8和巖藻糖基化甲胎蛋白的表達增加已被用于肝癌的診斷[15]。沈慶等[16]通過逆轉錄-聚合酶鏈反應對肺癌組織、癌旁正常肺組織的研究發現，Fut7基因mRNA在肺癌組織中表達量明顯高于癌旁正常肺組織，在腺癌組織表現最強；Fut7基因mRNA表達與TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移、組織學類型有關，而與年齡、性別無關，表明Fut7基因mRNA表達可能與肺癌的發生及轉移相關。有研究表明，大多數鱗狀上皮細胞癌、卵巢癌和胃癌患者的血清FucT的活性明顯升高，治療后復測血清中的FucT顯著下降，表明腫瘤患者血清中FucT活力與腫瘤病灶的大小和腫瘤轉移有密切的關系[17]。

Wannhoff等[18]研究發現，Fut2的常見變異和血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平相關，可影響原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)患者的腫瘤篩查，CEA對PSC患者膽道惡性腫瘤具有篩查意義，尤其是不表達糖類抗原(carbohydrate antigen，CA)199的患者。在研究隊列中，無癌癥患者的總體中位CEA值為1.4 ng/mL，患者Fut2的rs601338(G428A)變異與CEA水平顯著相關(P<0.001)。膽管惡性腫瘤患者血清CEA水平為2.0 ng/mL，與不能合成CA199患者的Fut2的G428A變異型比較，差異有統計學意義，表明聯合使用CEA檢測和Fut基因分型測定可早期發現膽管惡性腫瘤。

H?ti等[19]運用蛋白質組學方法分析雄激素依賴性和雄激素抗性的人類局部晚期前列腺癌細胞系LAPC4細胞的研究發現，Fut8在雄激素抗性的LAPC4細胞中顯著過表達，在非甾體抗雄激素治療的LAPC4細胞和體內去勢瘤異種移植模型中得到獨立證實，同時發現，Fut8的過表達可能是前列腺癌中前列腺特異性抗原表達下降的原因之一。因此，糾正惡性細胞內的巖藻糖基化，并抑制腫瘤生長，改變糖基化類型或水平可能成為腫瘤治療的新策略。

3 FucT與動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化由多因素共同作用引起，發病機制復雜，已成為我國病死率最高的疾病之一，高血壓、糖尿病、高脂血癥、肥胖和吸煙等均為動脈粥樣硬化的主要危險因素，其特征是循環單個核細胞黏附于內皮細胞并遷移到內皮下間隙，且黏附由白細胞和內皮細胞表面表達的選擇素等分子介導。Djoussé等[20]發現，Fut3基因的功能性變異可能與動脈粥樣硬化性疾病的患病率升高有關，尤其是戒酒者，但不包括正在飲酒者，表明飲酒可能會修正路易斯基因相關的缺血性心臟疾病。該研究對危險分層有幫助，但仍需進一步研究確定其生物學機制。

有研究發現，Fut7缺乏小鼠動脈粥樣硬化病變會大幅度減少，而Fut4缺乏小鼠減少不顯著，表明Fut7和Fut4在動脈粥樣硬化形成中具有協同作用，且以Fut7作用為主[21]。Gitlin 等[22]研究發現，選擇性破壞E選擇素配體和P選擇素配體的合成可使動脈粥樣硬化顯著減少，進一步的研究證實，動脈粥樣硬化形成過程中Fut7對白細胞的作用比內皮細胞更重要。未來還需要更多的研究來確定FucT活性在動脈粥樣硬化階段的作用。

4 FucT與炎癥

炎癥是機體對刺激的防御反應，由多種細胞及因子參與，可引起組織損傷的因素均可能成為炎癥的原因。炎癥可發生在任何部位，特殊部位或器官的炎癥可造成嚴重后果，甚至危及生命。Kashiwazaki等[23]研究發現，碳水化合物的結構包括Lex，參與細胞-細胞識別和炎癥反應，不是在Fut9-/-突變小鼠體內合成的。應用高神經毒性小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)JHMV srr7檢測Fut9-/-突變小鼠和野生型小鼠不同組織炎癥反應的病理研究發現，Fut9-/-突變小鼠腦組織感染后炎癥反應較野生型小鼠廣泛，但病毒滴度較野生型小鼠低；感染后，野生型小鼠脾臟細胞數量減少，但Fut9-/-突變小鼠并未減少；除β干擾素外，Fut9-/-突變小鼠與野生型小鼠腦組織中的細胞因子水平無明顯差異，其中，γ干擾素、白細胞介素6和單核細胞趨化蛋白1在Fut9-/-突變小鼠的表達水平高于野生型小鼠；此外，Fut9-/-突變小鼠對內毒素的體內接種不敏感，表明Lex結構參與了宿主對病毒或細菌的反應。Kudo等[24]的研究表明，Fut9-/-基因小鼠缺乏Lex,但早期胚胎和生殖細胞的發育正常。后續研究發現，Fut9-/-小鼠和野生型小鼠的大腦無明顯病理差異，但Fut9-/-小鼠在暗光和高強度的行為測試(迷宮測試)中表現出更多的焦慮反應[25]。Bogoevska等[26]研究發現，CEA相關細胞黏附分子1作為免疫球蛋白超級家族中的一員，可攜帶多種Lex結構。CEA相關細胞黏附分子1與不同FucT聯合表達的研究發現，Fut9在Lex合成中起關鍵作用；人結腸黏膜中的CEA同樣攜帶Lex殘基，可見，Lex結構的表達并不限于CEA相關細胞黏附分子1，故認為FucT可能間接參與了生理和病理條件下的免疫應答，如炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤。綜上所述，FucT參與了炎癥過程，如果有效抑制FucT并干擾Lex的表達，可能會降低炎癥反應程度。

5 FucT與胚胎著床

哺乳動物生殖過程中，胚胎細胞黏附后植入子宮內膜是妊娠成功的關鍵，隨后成熟的囊胚定位、黏附并嵌入接受性子宮內膜中。胚胎著床發生在有限的時期(著床窗)，這個關鍵階段許多因素(激素、生長因子、細胞因子等)可以調節子宮內膜細胞的分子改變[27-28]。糖基化在決定子宮內膜對胚胎的接受性方面起重要作用。有證據表明，FucT在哺乳動物生殖過程中有一定特異性表達，植入當天小鼠子宮內膜細胞中Fut1、Fut4、Fut7和Fut9的表達達到高峰，有利于子宮接受性的建立和維持[29-31]。Zhang等[32]發現，Fut4可通過調節子宮內膜上皮表面Ley的合成來調節胚胎細胞的黏附，故認為Fut4表達水平與子宮內膜容受性密切相關，可作為評價子宮內膜功能的重要指標。Zhang等[33]向早孕大鼠胚胎內注射含有人類全長Fut7 cDNA的質粒，產生Fut7超表達，sLex的表達同時增加，且體外、體內胚胎黏附率和胚胎著床率均顯著升高，故認為Fut7表達降低導致的sLex表達降低可能是人類不孕的原因之一，可通過上調FucT的表達促進胚胎植入，從而提高妊娠成功率。

6 FucT與炎癥性腸病

7 FucT與免疫

人體依靠免疫功能識別自身成分，破壞和排斥進入人體的其他物質，如病毒、損傷細胞和腫瘤細胞等。免疫功能降低，患感染性疾病的概率將升高，甚至發生免疫缺陷疾病。Parmar等[38]研究發現，人調節性T細胞中加入巖藻糖后，可在P選擇素糖蛋白配體1上形成sLex結構，從而改善細胞轉運模式，選擇素途徑招募者Fut6可顯著增加細胞表面巖藻糖基化。巖藻糖基化細胞在體內持久性增加，可提高移植物抗宿主病存活率，并提高異種移植物抗宿主病小鼠模型的總存活率。如研究結論成立，擴展的人類臍帶血細胞在體內的巖藻糖基化可提高其持久性和抗移植物抗宿主病能力，將使更多患者受益于第三方臍帶血衍生細胞過繼治療成為可能。

8 FucT與類風濕關節炎

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因未明的慢性系統性疾病，可能與遺傳、感染等多因素有關，現已發現多種細胞因子參與其發生發展過程。吳紅等[42]發現，E選擇素在RA早期滑膜組織中表達升高，E選擇素早期已表達于RA進程中，推測其在病程早期引起的血管生成中起非常重要的作用[43]。楊明輝等[44]發現，RA患者關節液和血清中P選擇素明顯升高，且關節液P選擇素水平明顯高于血清。Lex、sLex是細胞黏附分子選擇素的共同配體，而FucT是產生sLex及Lex的重要物質。闞鵬等[45]報道，RA患者膝關節滑膜組織中Fut5顯著高表達，且在RA滑膜炎癥過程中，Fut5與巨噬細胞、中性粒細胞、成纖維細胞和活性T淋巴細胞存在共定位，提示其可能參與了白細胞向炎癥部位遷移的過程。Isozaki等[46]發現，RA滑膜組織中α-1，2連接的巖藻糖基化總蛋白顯著高于正常滑膜組織，Fut1在RA滑膜組織細胞中的表達與滑膜組織炎癥呈正相關。同時還發現，滑膜成纖維細胞中的Fut1在血管生成、白細胞-滑膜成纖維細胞黏附和滑膜成纖維細胞增殖中起重要作用，均是RA發病過程的關鍵環節。現階段腫瘤壞死因子拮抗劑及白細胞介素6受體拮抗劑作為RA的有效治療手段，已廣泛應用于臨床。

9 FucT與耐藥

FucT是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)過程中細胞表面抗原合成的關鍵酶。Che等[47]分析慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)MDR過程中α(1，2)-FucT的變化發現，CML患者3種MDR細胞株和外周血單個核細胞中Fut1過表達，但Fut2無明顯變化。Fut1水平的改變對K562和K562/阿霉素 (adriamycin，ADR)細胞的MDR表型變異、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路活性及P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表達有顯著影響。特異性抑制劑或EGFR抑制劑阻斷EGFR/MAPK通路導致K562/ADR細胞的MDR降低，表明α(1,2)-FucT參與CML細胞MDR的發生，可通過Fut1調控EGFR/MAPK信號通路的活性和P-gp的表達。

Fut4與肝細胞癌的MDR有關，Cheng等[48]報道，Fut4通過激活PI3K/Akt信號通路和增加MDR相關蛋白1(MDR-related protein 1，MRP1)的表達影響肝細胞癌對藥物的敏感性。分析FucT家族在3對親代和耐藥人肝癌細胞系中的表達譜表明，Fut4、Fut6和Fut8在MDR細胞株中主要表達，提示Fut4、Fut6或Fut8介導的人肝癌MDR與PI3K/Akt通路的激活和MRP1的表達有關，而與P-gp的表達無關，提示Fut家族可能是調節人肝癌MDR的新機制。

10 小 結

目前發現，FucT參與健康和疾病狀態下多項生物學進程。隨著研究的深入，不斷發現其在不同疾病中的參與機制及作用。在腫瘤發生發展中，蛋白的巖藻糖基化類型及其水平會發生變化，且不同腫瘤細胞具有不同的特點。因此，開發針對特定FucT的強效選擇性抑制劑非常重要，但有限的結構信息阻礙了特定抑制劑的設計開發。為了達到滿意的親和力，有效的FucT抑制劑都含有磷酸核苷酸，但這些分子具有高極性或負電荷，使其難以跨越或不可能擴散至細胞膜[8]。有研究表明，供體底物的含氟類似物是糖基轉移酶的有效抑制劑。Rillahan等[49]指出，唾液酸和巖藻糖的過乙酰化類似物在細胞內被轉化成相應的唾液酸和FucT的供體底物類似物。代謝反饋的存在使這些抑制劑可阻止天然底物的重新合成并有效阻斷水解和巖藻糖基結構光譜的合成，從而導致細胞表面糖基的重塑。未來對FucT家族目標特定成員研究的進一步完善，將對治療干預的發展有重要意義。