冠心病P2Y12基因多態性與氯吡格雷抵抗的相關性研究

王珣 張遠恒 張弛

(1.武漢市第三醫院心內科，湖北 武漢 430060；2.武漢科技大學附屬普仁醫院心內科，湖北 武漢 430081)

冠心病是臨床常見的心血管疾病之一，近年來隨著高血壓、糖尿病等基礎性疾病發病率的上升，冠心病的發病率也呈現出逐步上升的趨勢。冠心病會導致患者不良心血管事件的發生。對冠心病患者進行介入治療，能夠改善患者的臨床轉歸。氯吡格雷能夠在改善冠心病介入治療后的高凝狀態等方面發揮積極作用，可有效降低介入術后血栓形成的風險[1-2]。不同等位基因位點的改變，會影響到冠心病介入治療患者的遠期抗血小板治療效果、凝血功能障礙及繼發性血小板性血栓的形成，進而影響到臨床治療結局[3-5]。為了揭示不同的等位基因多態性的改變對冠心病介入治療后血小板抵抗的影響，本次研究選取300例冠心病介入治療后采用氯吡格雷進行抗血小板治療的患者作為研究對象，探討P2Y12基因G52T多態性位點與氯吡格雷抵抗的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2016年1月在我院進行介入治療后采用氯吡格雷進行抗血小板治療的冠心病患者300例為研究對象，根據血小板聚集率不同分為氯吡格雷抵抗組(抵抗組)43例、非氯吡格雷抵抗組(非抵抗組)257例。抵抗組中男25例、女18例；年齡48～79歲，平均(62.3±10.7)歲。非抵抗組中男140例、女117例，年齡44～79歲，平均(63.6±12.4)歲。納入標準：(1)冠心病的診斷標準參考人民衛生出版社第八版《內科學》、美國心臟病協會(AHA)/美國心臟病學會(ACC)制定的相關標準；(2)患者經冠脈造影檢查確診為冠心病；(3)在我院接受介入治療，采用氯吡格雷進行抗血小板治療；(4)患者的臨床基線資料完整。排除標準：(1)伴有腫瘤疾病者；(2)近一周使用GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑治療者；(3)患者接受抗血小板治療前的血小板計數<100×109/L；(4)伴有嚴重的心功能、肝腎功能障礙者；(4)伴有消化道出血、貧血者；(5)伴有甲狀腺功能疾病者。兩組患者的性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2收集資料及分組方法 收集所有納入對象的年齡、性別、體質量指數(BMI)、吸煙史、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、伴隨疾病情況、冠脈病變支數。分組方法：ADP誘導的血小板聚集率較基線水平降低<10%或氯吡格雷維持治療是血小板聚集率>50%的患者為氯吡格雷抵抗組。未達到上述標準的患者為非氯吡格雷抵抗組。

1.3P2Y12基因多態性檢測 取凍存的血清保存液體，按照10 000 r/min的離心速度進行離心分離，每1 mL的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 mL的氯仿，進行裂解操作，4℃冰上采用無酶的RNA沖洗液進行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5 μL，37℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，使其逆轉錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應體系中加入SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達20 μL，上機，反應條件為：93℃ 2 min、93℃ 1 min、55℃ 2 min，共40個循環。

2 結 果

2.1兩組患者的資料比較 兩組患者的年齡、性別、吸煙率、HDL-C、TG、合并高血壓疾病率、冠脈病變支數比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；抵抗組患者的LDL-C、TC、HbA1c、糖尿病合并率均顯著的高于非抵抗組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者資料比較

2.2兩組患者的P2Y12基因G52T多態性及等位基因頻率比較 抵抗組患者的P2Y12基因G52T多態性中GT、TT顯著高于非抵抗組，差異有統計學意義(P<0.05)；抵抗組患者的等位基因頻率T顯著高于非抵抗組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者的P2Y12基因G52T多態性及等位基因頻率比較[n(%)]

2.3氯吡格雷抵抗與P2Y12基因G52T多態性的關系 以是否發生氯吡格雷抵抗作為因變量，P2Y12基因G52T多態性、LDL-C、TC、糖尿病合并率作為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示：P2Y12基因G52T位點GT、TT頻率增高OR(95%CI)=2.048(1.574～7.028)(P<0.05)，合并糖尿病是氯吡格雷抵抗的危險因素OR(95%CI)=1.776(1.309～4.881)(P<0.05)。見表3。

表3 氯吡格雷抵抗與P2Y12基因G52T多態性Logistic回歸分析

3 討 論

冠心病是由于心臟血管血流供應障礙導致心肌細胞的缺血性壞死，從而致使心血管系統發生難以逆轉的病理改變。氯吡格雷抗血小板治療，一方面能夠改善患者血小板高凝狀態導致的繼發性血栓的形成，另一方面可以改善局部內皮損傷或者冠心病本身等高危因素導致的血栓形成。但較高的血小板抵抗仍然是目前臨床上影響氯吡格雷治療效果的主要因素，過高的血小板抵抗加劇了患者心血管系統不良臨床預后的發生[6-7]。

P2Y12基因是影響血小板聚集或者表面活化的重要因素，過度的P2Y12基因的激活，可以對患者的血小板的富集或者纖維蛋白的交鎖等發揮作用。而P2Y12基因多態性可以影響半胱氨酸及含巰基氨基酸的代謝，導致中間代謝產物的上升，并影響到血小板聚集的程度，促進血小板性血栓的形成，并可影響到血小板的穩定性，促進血栓脫落[8-9]。同時，P2Y12基因多態性可以引起TG、TC及HDL等血脂指標的代謝異常，增加血小板表面活化因子b的合成，促進了血小板表面蛋白ⅡB的表達，促進了血小板抵抗的形成[10-11]。已有的研究探討了其他位點的多態性對于氯吡格雷抵抗的影響的，但迄今為止缺乏對于P2Y12基因G52T多態性的相關研究。

在發生氯吡格雷抵抗的患者血清中，可以通過RNA相關檢測技術發現P2Y12基因G52T多態性存在明顯的等位基因的表達差異，其中P2Y12基因G52T多態性GT或者TT等位基因的表達差異較為明顯，明顯高于氯吡格雷非抵抗組，提示GT或者TT等位基因的問題可能影響到了氯吡格雷抗血小板的臨床效果，從機制上考慮，P2Y12基因G52T多態性的GT或者TT等位基因的差異，可以通過影響下列幾個方面的機制導致氯吡格雷抵抗的發生[12-13]：(1)GT或者TT的高表達，促進了P2Y12蛋白翻譯過程中末端巰基結構的合成或者修飾，導致P2Y12蛋白的四級空間結構受到了一定的影響；(2)GT或者TT的高表達，能夠在影響局部血小板表面蛋白IIB或者IA的配體結合活性，或者加劇血小板的粘附能力等方面形成一定的生理效果，從而影響血小板抵抗的發生。刑元[14]，吳小利等[15]研究者在探討了大樣本量的臨床多中心臨床數據后發現，發生氯吡格雷抵抗的患者中，相關等位基因的表達差異較為明顯，特別是等位基因GT的表達增加，促進了患者氯吡格雷的高劑量或者長時間治療結局的發生，加劇了氯吡格雷抵抗的發生風險。在探討其他因素對于氯吡格雷抵抗的影響過程中發現，抵抗組患者的血清中可以發現其具有明顯的血脂或者血糖代謝紊亂，特別是LDL-C、TC、HbA1c等可能在影響氯吡格雷的半衰期或者氯吡格雷的肝臟代謝等方面發揮作用，促進患者氯吡格雷治療過程中抵抗的發生。最后，相關的危險因素回歸分析也可見，GT、TT頻率增高、合并糖尿病及血脂異常是影響氯吡格雷抵抗的主要因素，進一步提示了等位基因的表達差異對于氯吡格雷抵抗的影響。