槜李葉片DNA提取方法探討

李白，李軍，王蕾，種高軍*

(1.嘉興市農業科學研究院，浙江 嘉興 314016； 2.嘉興職業技術學院 農業與環境分院，浙江 嘉興 314036)

槜李是薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL.)植物中栽培中國李(PrunussalicinaLindl.)的一個品種群，原產于浙江省嘉興市，桐鄉槜李于2011年獲農產品地理標志保護登記[1]。槜李果實熟透后果肉化成漿液，有酒香味，品質上乘，經濟價值高[2]。提取高質量的植物基因組 DNA 是有效開展分子育種、品種鑒定、基因功能研究等分子生物學研究的前提[3-4]。槜李為多年生木本植物，體內富含酚類、色素、多糖等物質，這給其DNA提取帶來困難，其中多糖污染是DNA提取中最常遇到的問題[4-7]。多糖污染的DNA較黏稠，呈膠狀，不利實驗操作，且多糖對后續分子生物學反應體系中的酶活性可能產生抑制作用，影響下游研究[5,7-8]。常規的 DNA 提取方法不能有效除去多糖，提取木本果樹DNA質量較差[4,9]。經典的CsCl梯度離心能有效除去木本果樹的多糖，獲得的DNA純度高，但CsCl梯度離心設備費用高昂，操作不便，且DNA得率低，應用范圍有限。隨著分子標記等分子生物學技術的發展，實驗樣品數量快速增長，DNA提取方法應考慮對實驗人員與環境的安全，并適用于批量提取大量樣品，且盡量避免使用有害試劑[10-11]。本研究報道了一種適用于槜李葉片高質量基因組DNA提取的方法，為槜李等富含多糖的木本果樹葉片的基因組DNA提取提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

槜李葉片采自浙江省嘉興市農業科學研究院古塘基地果樹園區，采摘后放入冰盒帶回實驗室，置于-86 ℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 試劑

CTAB、SDS、PVP、β-巰基乙醇、EDTA、Tris均購于上海生物工程公司，其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 槜李葉片DNA常規提取

樣品處理：取0.1 g槜李葉片轉入2 mL離心管中，加入1顆5 mm鋼珠，準備12份，經液氮速凍后用震蕩破碎儀1 000 r·min-1破碎至粉末狀，分4組，每組3管，4組分別用CTAB法、SDS法、高鹽法和硅膠膜法提取DNA。

CTAB法：破碎后加入CTAB提取液(100 mmol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA，1.5 mol·L-1NaCl，2% CTAB，1% PVP，1% β-巰基乙醇，pH 8.0)，65 ℃提取，分別用V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)為25∶24∶1和V(氯仿)∶V(異戊醇)為24∶1的溶液抽提上清，用預冷異戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗2次，風干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

SDS法：破碎后加入SDS提取液(100 mmol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA，0.5 mol·L-1NaCl，2% SDS，1% PVP，1% β-巰基乙醇，pH 8.0)，65 ℃提取，加5 mol·L-1KAc沉淀蛋白等雜質，用預冷異戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗2次，風干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

高鹽法：破碎后加入TPS提取液(100 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1EDTA，1 mol·L-1KCl，1% PVP，1% β-巰基乙醇，pH值8.0)，75 ℃提取，上清用預冷異戊醇沉淀DNA，70%乙醇漂洗1次，風干后加100 μL TE溶解，-20 ℃保存。

硅膠膜法：破碎后加入DNA-Silica結合液(100 mmol·L-1NaAc，20 mmol·L-1EDTA，1.5 mol·L-1NaCl，2% CTAB，1% PVP，1% β-巰基乙醇，pH 6.0)，65 ℃提取，取上清加入純化柱中(含硅膠膜)，靜置片刻，離心后棄廢液，用70%乙醇沖洗2次，風干去乙醇，加100 μL TE溶解，-20 ℃保存備用。

1.2.2 CTAB法純化DNA

硅膠膜法提取DNA濃度較低，不做純化處理。CTAB、SDS、高鹽法凍存DNA各取一管，吸取50 μL，加入4 μL 5 mol·L-1NaCl與6 μL 10% CTAB，混勻后離心，沉淀用體積比3∶1的100 μL TE與5 mol·L-1NaCl混合液重懸，加2體積預冷乙醇沉淀DNA，用70%乙醇漂洗2次，風干后加50 μL TE溶解，-20 ℃保存備用[12]。

2 結果與分析

2.1 常規提取方案比較

DNA條帶電泳如圖1，D值見表1。電泳圖中可以看出，CTAB、SDS和高鹽法提取的DNA存在彌散條帶，點樣孔有雜質，根據D值推測，DNA中可能殘留一些多糖雜質。硅膠膜法提取的DNA條帶亮度低，根據D值推測，DNA濃度較低，可能殘留多糖雜質。

C1～3為CTAB法提取DNA；S1～3為SDS法提取DNA；Y1～3為高鹽法提取DNA；Z1～3為硅膠膜法提取DNA；M為DL2000 DNA 分子量標準；→為基因組DNA所在位置圖1 CTAB、SDS、高鹽和硅膠膜法提取 DNA電泳結果

樣品濃度/(ng·μL-1)D260/D280D260/D230C1373.1±336.12.10±1.211.86±0.27S1122.9±158.22.13±0.311.66±0.39Y2739.1±256.51.98±0.511.49±0.23Z139.4±13.11.79±0.150.87±0.23

注：C、S、Y、Z分別為CTAB法、SDS法、高鹽法、硅膠膜法提取的DNA。

2.2 CTAB純化效果

純化后的DNA條帶如圖2，D值見表2。圖中可以看出，CTAB、SDS和高鹽法提取的DNA經CTAB法純化后，RNA、彌散帶和點樣孔雜質均不同程度減少，根據D值推測，DNA濃度有所降低，這一方面是純化的損失，另一方面可能是多糖雜等雜質的減少，這些雜質原本具有一定的吸光值。其中高鹽提取DNA純化后下方彌散帶增加，可能與原樣品雜質含量較高有關。

C為CTAB法提取DNA；Cc為C純化后產物；S為SDS法提取DNA；Sc為S純化后產物；Y為高鹽法提取DNA；Yc為Y純化后產物；→為基因組DNA所在位置圖2 CTAB法純化后DNA電泳結果

樣品濃度/(ng·μL-1)D260/D280D260/D230純化前純化后純化前純化后純化前純化后C1 099.5731.62.072.151.802.26S990.9465.42.002.071.342.14Y2 558.21 299.51.902.151.402.29

注：C、S、Y分別為CTAB法、SDS法、高鹽法提取的DNA。

3 討論

本研究分別用CTAB、SDS、高鹽和硅膠膜4種方法提取槜李葉片DNA，通過DNA濃度、純度、電泳條帶和可操作性評價4種方法。結果表明：CTAB法提取DNA基因組DNA條帶完整，有雜帶，殘留一定RNA和多糖雜質，除蛋白過程需氯仿抽提，操作繁瑣；SDS法電泳條帶與CTAB法相似，多糖殘留較CTAB法多，操作較CTAB法簡易；高鹽法濃度最高，操作簡易，但雜質多；硅膠膜法DNA操作簡易，但DNA濃度低，殘留多糖雜質。4種方法提取的槜李葉片DNA均存在不同程度的雜質污染，尤其是多糖雜質，這與前人關于果樹DNA提取結果的分析一致[4,8,11,13]。

CTAB是一種表面活性劑，能裂解細胞，并能與DNA可逆結合，這種作用受鹽濃度影響：當NaCl>1 mol·L-1時，不能形成復合物，DNA呈溶解狀態；當NaCl<0.2 mol·L-1時，DNA與CTAB形成復合物，呈沉淀狀態；當NaCl在0.3～0.4 mol·L-1時，CTAB與單鏈核酸結合效率非常低[14]。從實驗結果看，用CTAB純化的DNA產物，能有效去除RNA、彌散帶和多糖雜質。DNA提取方法中，CTAB法提取基因組DNA質量也較其他方法好，但過程需氯仿抽提，對實驗人員和環境均有危害，且操作繁瑣，抽提取上清時易吸到雜質(圖1，C2泳道)，不利于批量提取大量果樹葉片。

高鹽法由高溫裂解、低溫沉淀和乙醇洗滌3個簡單步驟組成，僅需要Tris、EDTA、KCl、異丙醇和乙醇5種常規試劑，操作簡便，常用于批量提取大量水稻基因組DNA，且DNA質量較好，便于后續分子實驗開展，但用于槜李等富含多糖的植物基因組DNA提取，產物中雜質含量高。

在低pH高鹽環境下，DNA的磷酸基團與硅膠膜表面硅烷醇基團之間形成氫鍵，使DNA吸附在硅膠膜表面，硅膠膜法利用這一特點從細胞裂解液中分離出DNA，絕大多數DNA提取試劑盒采用了這種方法[15]。但受硅膠膜數量限制，結合的DNA總量有限，而且硅烷醇基團會受到一些雜質競爭性結合，并與DNA一同洗脫，一方面降低得率，另一方面雜質含量高，本實驗結果也驗證了這點，其中雜質從D值推測主要是多糖。

SDS法用SDS裂解細胞釋放DNA，因KAc、SDS和蛋白質三者在低溫下可形成復合物沉淀，所以用KAc代替氯仿去除蛋白，提取的DNA與CTAB法比較，電泳結果相似，多糖雜質略多，過程未使用有害試劑，操作較CTAB法簡單。由于殘留多糖可用CTAB純化法去除，因此可先用SDS法提取槜李葉片DNA，再用CTAB純化法純化，以獲得高質量基因組DNA。對這種組合提取法可進一步優化，減少操作步驟，更適合批量化提取操作。