HPLC-Q-TOF/MS法同時測定漁用飼料中磺胺類和喹諾酮類藥物殘留

柯慶青，李詩言，貝亦江，周凡，鄭重鶯，王鼎南，丁雪燕，王揚

(浙江省水產質量檢測中心，浙江 杭州 310023)

近些年來，隨著水產養殖業的不斷發展，水產品的質量安全問題逐漸引起人們關注。磺胺類(SAs)和喹諾酮類(QNs)藥物是人畜通用的抗生素類藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、作用迅速等特點，在畜牧、水產等養殖業中常作為飼料添加劑或動物疾病治療藥物[1-2]。磺胺和喹諾酮類抗生素具有一定的毒副作用，長期攝入含有磺胺和喹諾酮類的動物源食品，會導致抗生素在人體內殘留蓄積，使人體產生耐藥性并影響人體健康。中華人民共和國農業農村部235號公告要求，動物源性食品中磺胺類獸藥殘留總量不大于100 μg·kg-1，恩諾沙星(恩諾沙星+環丙沙星)限量為100 μg·kg-1[3]。漁用配合飼料是水產品養殖中重要的投入品之一，其質量直接關系到水產品的品質和安全。因此，建立飼料中磺胺類和喹諾酮類藥物的快速檢測方法對飼料的安全監管具有重要的意義。

磺胺類和喹諾酮類藥物的化學性質相似，比較容易用同一種方法提取，同時檢測。目前檢測磺胺類和喹諾酮類藥物的方法主要有酶聯免疫法(ELISA)[4-5]、毛細管電泳法(CE)[6]、液相色譜法(HPLC)[7-9]、液相質譜法(LC-MS)[10]、液相色譜串聯質譜法(LC-MS-MS)[11-17]等。其中毛細管電泳法靈敏度較低、選擇性較差；酶聯免疫法結果易出現假陽性，因此只能作為篩選方法；液相色譜法由于只靠保留時間定性，抗干擾能力較弱；液相質譜法雖然方法的靈敏度較高，但難以完全闡明目標化合物結構裂解的信息，準確定性方面有所欠缺。液相色譜串聯質譜法具有定性能力強，選擇性好，靈敏度高等優點，近年來，高效液相色譜串聯質譜法在獸藥殘留分析中得到廣泛應用。目前，采用高分辨、全掃描技術的四級桿-飛行時間質譜(Q-TOF)可以對多組分化合物進行精確的分子量測定，并可以通過與建立的化合物數據庫進行匹配檢索，快速、便捷地對目標化合物和未知化合物進行篩查和確定，具有靈敏度高、選擇性好、受基體干擾小、定性準確度高等優點。目前國內外基于Q-TOF對多組分化合物篩查的研究已涉及食品、醫藥、環境安全等多個領域。漁用飼料安全密切影響著水產品的質量安全，目前采用Q-TOF技術對漁用飼料中的磺胺類和喹諾酮類多組分藥物殘留的檢測分析研究相對較少。為建立一種高效、低干擾的漁用配合飼料中磺胺類和喹諾酮類藥物檢測方法，本方法采用酸化乙腈-乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶液提取體系進行提取，利用乙腈沉淀和冷凍離心的方式減少蛋白質干擾，采用新一代反相固相萃取吸附劑，在不用平衡活化的情況下有效地去除樣品中的脂肪和磷脂，較以往固相萃取劑具有更簡單、更快速、更潔凈的優勢[18]。同時，本研究利用高分辨高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜(LC-Q-TOF/MS)技術建立了7 min內快速篩查和定量檢測漁用配合飼料中的15種磺胺類和喹諾酮藥物殘留的方法，為飼料中非法藥物添加的監控提供更高效、準確的技術手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 待測樣品

飼料樣品均來自2016年浙江省水產質量檢測中心水產投入品監督抽查任務，所有樣品避光常溫保存，待檢測。

1.1.2 試劑

磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺對甲氧基嘧啶、磺胺間甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲基噠嗪、磺胺喹惡啉、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星，德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度均大于95%；乙腈(色譜純)，美國TEDIA公司；甲醇(色譜純)，美國TEDIA公司；甲酸(色譜純)，美國ROE Scientific Inc.公司。

1.1.3 儀器

1290-6540液相色譜、四級桿飛行時間質譜儀，美國安捷倫公司；2202S型電子天平，德國賽多利斯有限公司； TDL-5A離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；Centrifuge 5427R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；N-EVAP112水浴式氮吹濃縮儀，美國 Oranomation Aassociates Inc.公司；Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱、0.22 μm GHP過濾頭，美國 Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取1.00 g飼料樣品于15 mL帶蓋聚乙烯離心管中，加入10 mL 0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液，渦旋均勻30 s后加入10 mL 0.1%甲酸乙腈，高速振蕩10 min，放入冰箱冷凍20 min后，5 000 r·min-1離心5 min，取一半體積上清液過0.22 μm GHP濾頭后氮吹近干，加入3 mL超純水復溶后，將提取液加入Oasis PRiME HLB固相萃取柱，保持每秒1滴的流速流出，10%甲醇水溶液淋洗，6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液在40 ℃下氮氣吹干，用0.1%甲酸乙腈∶水為1∶9的流動相定容至1 mL，漩渦使其充分溶解后加入1 mL正己烷，快速漩渦1 min， 4 000 r·min-1離心5 min，棄去正己烷層后過0.22 μm微孔濾膜，上機測試。

1.2.2 色質譜條件

以0.1%甲酸溶液(流動相A)和甲醇(流動相B)溶液為色譜流動相進行梯度洗脫。色譜柱為Aglient Plus C18(3.0 nm×100 nm，1.8 μm)，流速為250 μL·min-1，柱溫30 ℃。梯度洗脫程序設定為：0～1 min，5% B；1～5 min，5%～30% B；5～8 min，30%～50% B；8～15 min，50%～98% B；15～18 min，98% B。

離子源為Dual AJS ESI源，掃描方式為正離子全掃描，全掃描范圍：m/z50～1 000，毛細管電壓4 000 V，鞘氣溫度400 ℃，鞘氣流速12.0 L·min-1，干燥氣流,8.0 L·min-1，干燥氣溫度325 ℃，誘導解離電壓130 V。采集數據時采用參比液(C5H4N4，其離子精確相對質量為121.050873)實時進行質量校準。

2 結果與分析

2.1 預處理方法的選擇與優化

2.1.1 提取試劑的選擇

漁用配合飼料主要來源于動物源原料(魚粉、蠶蛹等)和植物性原料(豆餅、菜籽餅、谷實類等)，在檢測獸藥殘留的過程中主要干擾物有蛋白質、脂肪、色素、糖類等，因此選擇合適的前處理方法尤為重要。

配合飼料基質較為復雜，單一試劑提取雜質較多，會給后期的凈化帶來困難，經過試驗優化，本試驗采用酸化乙腈-0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液提取體系。在加入有機溶劑提取前，先用0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液對樣品進行處理。有研究發現，在加入有機溶劑前，用水將樣品分散可增加大部分藥物的提取回收率[19]，這可能由于水提前加入均質可以將飼料樣品充分分散，增大了有機溶劑和樣品的接觸面積，有利于水溶性藥物的溶解，同時螯合劑Na2EDTA的加入可絡合飼料中存在的大部分金屬離子，可改善喹諾酮類藥物的峰形，提高提取回收率。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯是常見的提取試劑，相較于甲醇和乙酸乙酯，乙腈具有較強的提取效率且具有沉淀蛋白的作用。由于磺胺類和喹諾酮類藥物都具有酸堿兩性性質，與純乙腈相比，0.1%甲酸乙腈提取效率更高。本實驗采用酸化乙腈-0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液提取后，提取液放入冰箱冷凍20 min后離心取上清液，加入乙腈，冷凍后使得蛋白沉淀。本實驗對比了水、乙腈分步提取和乙腈水溶液直接提取方法，發現用前者提取，上清液更澄清，提取回收率更高。若加入的有機溶劑比例過低，藥物的回收率偏低，當加入的有機溶劑比例為50%時，所有化合物的回收率均能較好地滿足分析要求方法。因此，本研究選用10 mL 0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液及10 mL 0.1%甲酸乙腈為提取溶劑。

2.1.2 凈化方法的選擇

目前飼料中藥物殘留檢測的前處理方法主要有QuECHERS方法和固相萃取法。本研究對2種方法進行了比較和選擇，在使用QuECHERS方法的過程中，由于飼料成分復雜，基質效應較大，基質干擾較為明顯，常用的吸附劑如PSA、GCB等對部分目標藥物有一定的吸附，導致方法的靈敏度較低。

樣品經過乙腈沉淀及冷凍離心后已經去除了大部分蛋白質，但仍可能存在少量的脂肪、色素等雜質。本研究采用了新型反相固相萃取Oasis PRiME HLB固相微萃取柱對提取液進行凈化， 可有效去除脂肪、磷脂、部分色素等雜質干擾，且填料具有水可浸潤性，無須活化和平衡，在高水相的情況下，填料對目標化合物有較好的保留和較高的載量，蛋白質等雜質不被保留而與目標物分離。用高洗脫強度的有機試劑將目標化合物洗脫收集，而部分動物性油脂非極性雜質則會保留在小柱上，有效實現目標化合物和雜質的分離。且從塔板理論來說，固相微萃取小柱塔理論板數為幾百，相較于塔板數為1的QuEchERs的通過策略，固相微萃取凈化效率較高。因此本研究預處理采用Oasis PRiME HLB固相微萃取柱進行富集、凈化。由于乙腈洗脫能力過強，可將色素等雜質一起洗脫下來，故選擇甲醇為洗脫液。

2.2 色譜條件優化

磺胺類和喹諾酮類藥物均溶于甲醇，選擇甲醇-水體系作為流動相，由于磺胺類和喹諾酮類均屬于兩性物質，色譜峰較易拖尾，在流動相中加入0.1%甲酸，可以一定程度上改善峰型，并且增強離子化效率，提高檢測靈敏度。由于不同藥物的極性有所差異，采取梯度洗脫的方式進行洗脫，7 min內可完成15種藥物的分析(圖1)。

1，磺胺嘧啶；2，磺胺吡啶；3，諾氟沙星；4、氧氟沙星；5，環丙沙星；6，磺胺二甲基嘧啶；7，丹諾沙星；8， 磺胺對甲氧基嘧啶；9，恩諾沙星；10， 磺胺間甲氧基嘧啶；11，沙拉沙星；12，磺胺甲噁唑；13，磺胺鄰二甲氧嘧啶；14，磺胺二甲基噠嗪；15，磺胺喹惡啉圖1 15種磺胺和喹諾酮藥物的提取離子流

2.3 數據庫的建立

化合物篩查數據庫是篩查目標獸藥的判定依據，本研究通過 Agilent Mass Hunter Workstation軟件(Version B 5.00)完成各化合物數據的采集與處理，Agilent Mass Hunter PCDL Manager軟件(Version B 4.00)完成化合物篩查數據庫的建立。建立化合物篩查數據庫時，在相同流動相的情況下，將一定濃度的磺胺類和喹諾酮類的標準溶液以正離子模式進行一級質譜掃描，找出各個化合物的母離子。進一步對母離子進行子離子掃描，得到各個化合物的二級質譜圖和特征子離子信息。為了保證篩查數據的完整性和可靠性，分別采集了毛細血管電泳為10、20和40 eV時各化合物的二級質譜圖加入譜庫，建立包括化合物精確分子量、保留時間、特征離子碎片信息的化合物數據庫。歐盟 2002/657/EC 決議要求，當使用高分辨質譜作為確證技術時，化合物的確證需要至少4個鑒別分數，其中檢測到1個結構碎片獲得2個鑒別分數，二級質譜中的每個子離子獲得2.5個分數，即1個具有精確質量數的母離子和 1個特征碎片子離子即可獲得4.5分的鑒定分數。本研究所建立的HPLC-Q-TOF/MS檢測方法中，每個化合物已經確證至少1個精確質量數的母離子和2個特征子離子，滿足超過4分的鑒定確證分數點的條件。表1列出了15種化合物的精確質量分子量、保留時間和特征離子碎片等信息。利用已建立好的數據庫對樣品進行藥物篩查，HPLC-Q-TOF/MS檢測篩查得分高于70分的獸藥(得分依據為精確質量數、保留時間和同位素豐度)，對初篩篩查出的獸藥采用建立好的Target-MS/MS方法進行檢測，從而獲得目標獸藥的碎片離子信息，并進行二級離子比對確證，通過基質加標的形式，消除基質效應，并通過外標法利用母離子對篩查出的化合物進行定量。

表1 15種目標物的保留時間以及質譜參數

2.4 標準曲線和定量限

由于飼料基質較為復雜，基質物質對目標化合物的分析過程有一定干擾。本實驗利用空白飼料樣品的基質溶液配制標準溶液進行定量分析，使標準曲線和實際樣品有相同的離子化環境，以減少基質效應對檢測的干擾。在選定的色譜條件和質譜參數下，以漁用配合飼料空白基質溶液配制6種質量濃度的混合標準工作溶液上機測試，15種藥物均以峰面積(Y)為縱坐標，對應的質量濃度(X，μg·L-1)為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程(表2)。結果表明，15種待測物的線性范圍均為10～500 μg·L-1，相關系數(R2)為0.988～0.997，表明各化合物具有良好的線性關系。采用標準添加法進行測定，以離子信噪比(S/N)>3確定樣品的檢出限(LOD)，S/N>10為定量限(LOQ)，得到15種化合物的LOD范圍為3.0～8.0 μg·kg-1，LOQ范圍為10.0～25.0 μg·kg-1。

2.5 回收率和精密度

為了考察檢測方法的可行性，向空白飼料樣品中添加3個濃度水平的15種獸藥的混合標準溶液，每組做6個平行，按照上述前處理方法和儀器條件進行測定，回收率和精密度結果見表3。

表2 15種目標物的線性方程、相關系數、 檢出限和定量限

表3 飼料中15種目標物的平均加標回收率和 精密度

2.6 實際樣品測定

對浙江省投入品監督抽查任務中抽查的80批次漁用飼料進行檢測，結果顯示，抽檢的飼料均無上述磺胺類和喹諾酮類藥物添加。考慮在實際生產中一般在飼料投喂前進行拌藥，而養殖生產現場抽取的基本上是未啟封的包裝飼料。在這個環節監控上，存在一定風險，所以飼料和漁用飼料的藥物殘留問題仍需連續監測。

3 結論

本試驗采用Oasis HLB固相萃取柱凈化方法對漁用配合飼料進行前處理，通過對前處理方法改進，色質譜條件優化，依據建立的化合物數據庫，建立了漁用配合飼料中9種磺胺類和6種喹諾酮類藥物的HPLC-Q-TOF/MS篩查方法。該方法具有簡單、靈敏、適用范圍廣等特點，適用于飼料中多種磺胺類和喹諾酮類藥物的快速篩查分析，其靈敏度和準確度均能滿足獸藥殘留檢測分析的要求，為飼料的質量安全監管工作提供有力工具。