扁豆花高效液相色譜指紋圖譜研究*

曹素梅，袁衛斌，陳洪英

（仲景宛西制藥股份有限公司，河南 鄭州 450003）

扁豆花為豆科扁豆屬植物扁豆Dolichos lablabL.的干燥花，其性味甘、平，歸脾、胃、大腸經，具有消暑、化濕、和中的功效，用于暑濕泄瀉、痢疾，主產于河南、安徽、浙江等地［1］。其主要含有原花青苷黃酮類、花青素、香豆精［2-3］、蘆丁［4］、木犀草素、大波斯菊苷、木犀草素-4′-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、野漆樹苷和甘露醇［5］等。目前對扁豆花的質量控制主要是采用定性鑒別和含量測定的方法［4-9］。中藥指紋圖譜研究技術更符合中藥的特點，在研究中藥有效成分、控制中藥質量及鑒別方面已日趨完善，且得到了國際廣泛認可［10-12］。為了系統、完整地反映扁豆花藥材的內在質量，參考了藥材指紋圖譜的建立方法［13-18］，建立了扁豆花的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012.1版本，以下簡稱評價軟件）進行相似度評價，為扁豆花藥材的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（DAD檢測器，在線脫氣機，四元梯度泵，柱溫箱，化學工作站，安捷倫公司）；MS-105型電子分析天平、AL104型電子天平（Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度為90.2% ，批號為 100080-201408）；水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，扁豆花藥材經河南中醫藥大學代麗萍教授鑒定為豆科扁豆屬植物扁豆Dolichos lablabL.的干燥花，產地信息見表1。

表1 10批扁豆花產地信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Luna C18100A 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：358 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表2）。分別吸取溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進行分析，在擬訂色譜條件下，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上有相應的色譜峰，經二極管陣列檢測器純度測試，二者一致，各色譜峰均達到了基線分離。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

稱取蘆丁對照品，精密稱定，用甲醇溶解并制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得對照品溶液。取藥材粉末（過40目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取同一供試品粉末，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計算。以7號峰為參照物，各共有峰相對保留時間的RSD均小于 0.5% （n＝6），相對峰面積 RSD均小于3.0% （n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密取同一供試品粉末，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計算。以7號峰為參照物，各共有峰相對保留時間的 RSD均小于0.5%（n＝6），相對峰面積的 RSD均小于 4.0% （n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品粉末，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h時進樣，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計算。以7號峰為參照物，各共有峰相對保留時間的 RSD均小于0.4%（n＝6），相對峰面積的 RSD均小于3.0%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.4 樣品測定

分別取10批扁豆花藥材樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別測定，記錄色譜圖。

2.5 扁豆花指紋圖譜分析

共有峰確定：根據10批扁豆花樣品分析結果，確定了12個共有峰，其中7號峰為蘆丁。以蘆丁峰為參照，各共有峰的相對保留時間見表3。色譜圖見圖1。

相似度計算及扁豆花對照圖譜的生成：采用評價軟件中位數法分析，以10批扁豆花生成的共有模式為對照，計算各批樣品相似度，計算結果見表4。10批樣品HPLC指紋圖譜共有模式圖及生成的對照圖譜見圖2和圖3。

表3 10批扁豆花指紋圖譜共有峰的相對保留時間（min）

3 討論

提取方法選擇：為了最大程度提取扁豆花中的化學成分，試驗中考察了甲醇、60%甲醇、95%乙醇的提取效果。結果表明，60%甲醇提取得到的信息最豐富。同時比較了超聲和回流提取，結果表明，兩者的提取效果差異不明顯，從操作簡便角度出發，選擇了超聲提取。

檢測波長選擇：本試驗中采用二極管陣列檢測器對扁豆花HPLC指紋圖譜進行全波長掃描，考察了257，310，358 nm波長處的圖譜特征。結果顯示，358 nm波長條件下，各成分峰峰形較好，峰面積適中，因此設定358 nm為檢測波長。

表4 10批扁豆花藥材相似度測定結果

圖1 高效液相色譜圖

圖2 10批扁豆花高效液相色譜指紋圖譜共有模式圖

圖3 扁豆花高效液相色譜對照指紋圖譜

流動相選擇：在色譜條件選擇過程中，共比較了乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液和乙腈-1%冰乙酸溶液4種流動相體系，結果顯示，不同的流動相體系對峰的分離效果差異較大。甲醇-0.1%磷酸溶液分離效果較差，乙腈-0.1%磷酸溶液分離效果較好，基線平穩，故被選為本試驗的流動相。

柱溫選擇：為了保持色譜分析的一致性，設定柱溫考察不同試驗環境下的色譜分析，分別考察了25，30，35℃ 3種柱溫。結果顯示，在30℃下，分離效果較好，故選擇30℃作為柱溫。

綜上所述，通過對10批扁豆花藥材的指紋圖譜分析，可見各主要色譜峰的相對保留時間基本一致，色譜峰的整體面貌基本一致，但峰面積有差異，說明了其成分含量的差異性。從相似度評價結果來看，相似度均大于0.9，說明地域差異不明顯。本研究中建立了扁豆花藥材的HPLC指紋圖譜分析方法，為扁豆花藥材質量的客觀評價提供了參考。