麥冬皂苷D′對心肌細胞H9c2細胞的細胞毒性研究*

林蕓蕓，顧申紅△，宋艷玲，蔡海云，譚 琰

（1.海南醫學院第一附屬醫院，海南 海口 570000；2.海南醫學院第一臨床學院，海南 海口 570000）

麥冬Ophiopogon japonicus（Linn.f.）Ker-Gawl.有生津解渴、潤肺止咳之功效［1］，有明顯的抗心肌缺血功效，化學成分含麥冬皂苷 A，B，B′，C，C′，D，D′等［2-3］。麥冬皂苷D（OPD）可通過調控細胞鈣通道穩態，從而抑制氧化應激，減少心肌細胞凋亡［4］；還可通過抗氧作用抑制阿霉素誘導的心肌自噬性損傷，發揮保護效應［5］。麥冬皂苷D′（OPD′）與OPD結構十分相似，然而至今對OPD′的藥物毒理研究很少。本研究中探討了OPD′對心肌細胞H9c2細胞的細胞毒性作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、儀器與試藥

細胞株：大鼠心肌細胞H9c2購自美國模式培養物保藏中心 （ATCC CRL-1446）。

儀器：c150型CO2細胞培養箱（德國Binde公司）；SW-CJ型超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；A10型超純水儀（美國Millipore公司）；DMI8型倒置顯微鏡（德國萊卡公司）；MDF-C8V1型-80℃超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；FC500MCL型流式細胞儀（美國Beckman公司）。

試藥：DMEM培養基（批號為10569010）；胰蛋白酶（批號為 25200056）；EDTA（批號為 AM9260G）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS，批號為 10099141）；二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，批號為 D2650），均購自美國Gibco公司。麥冬皂苷D′（上海一飛生物科技有限公司，HPLC法測定，含量≥98%，批號為41753-55-3）；MTS細胞毒性檢測試劑盒（美國Promega公司，批號為G1780）；Annexin V-FITC ／PI凋亡測定試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司，批號為 APOAF-20TST）；JC-1型線粒體膜電位檢測試劑盒（碧云天生物技術公司，批號為 C2006）。

1.2 方法

細胞株培養：大鼠心肌細胞H9c2為貼壁細胞，在含有10%FBS，100 U／mL青霉素和100 g／L鏈霉素的DMEM培養基中，置5%CO2、37℃ 細胞培養箱中培養。待細胞生長至約90%時，棄去原培養基，用PBS輕輕吹吸1～2次，后用預熱的0.25%胰蛋白酶消化、傳代，平均2 d傳代1次。

細胞存活率檢測：將H9c2細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按3×104個／孔的細胞密度均勻接種于96孔板。第2天待細胞貼壁生長后棄去培養基，用PBS洗去未貼壁細胞，加入新鮮培養基。OPD′組分別加入不同濃度（0.1，0.5，5.0，10.0 μmol／L）的OPD′，對照組則加等量不含藥物的培養液。繼續培養24 h后棄去上清液，每孔加MTS 20 μL和不含血清培訓基 100 μL，37 ℃孵育 0.5 ～1.0 h。用酶標儀在 480 nm波長下檢測各孔吸光度（A），并計算細胞存活率。細胞存活率 ＝1-（OPD′組 A490-校零孔A490／對照組 A490-校零孔A490）×100%。

心肌細胞凋亡能力檢測：根據Annexin V-FITC／PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。將H9c2細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按2×105個／孔的細胞密度均勻接種于6孔板。第2天待細胞貼壁生長后棄去培養基，用PBS洗去未貼壁細胞，加入新鮮培養基。OPD′組分別加入不同濃度（0.1，0.5，5.0，10.0 μmol／L）的 OPD′，對照組則加等量不含藥物的培養液。繼續培養24 h，棄去上清液，胰酶消化，離心，收集細胞，用250 μL結合緩沖液重懸細胞并調整細胞濃度約為1×106個／mL。向細胞懸液中依次加入Annexin V-FITC和PI溶液，混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，混勻后上流式細胞儀檢測分析。

心肌細胞周期檢測：按“心肌細胞凋亡能力檢測”項下自“將H9c2細胞”至“收集細胞”同法操作，70%冷乙醇（無水乙醇以PBS配制）固定過夜，PBS洗滌2次后棄上清液，PI染液冰浴30 min，將試管置室溫避光染色30 min，通過流式細胞儀分析細胞周期分布。

線粒體膜電位檢測：按“心肌細胞凋亡能力檢測”項下自“將H9c2細胞”至“加等量不含藥物的培養液”同法操作。繼續培養24 h，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。加入2 mL細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。采用流式細胞儀進行檢測，設置激發波長為525 nm，發射光波長為595 nm，測定熒光強度。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 OPD′對心肌細胞的細胞毒性

MTS法檢測OPD′對細胞的毒性見圖1。隨著OPD′處理濃度的增加，H9c2細胞數量呈明顯下降趨勢，其中5 μmol／L及以上濃度的OPD′對心肌細胞有明顯的毒性作用。

圖1 OPD′對H9c2細胞存活率的影響

2.2 OPD′對心肌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測OPD′對心肌細胞H9c2凋亡的影響。與對照組相比，OPD′5 μmol／L 組和 10 μmol／L 組凋亡率明顯上升（P＜0.05）。提示 5 μmol／L 及以上濃度的OPD′可誘導H9c2細胞凋亡。詳見表1。

表1 OPD′對心肌細胞凋亡率的影響（±s，% ）

表1 OPD′對心肌細胞凋亡率的影響（±s，% ）

組別 凋亡率（%）t值P值對照組OPD′組 0.1 μmol／L 0.5 μmol／L 5.0 μmol／L 10.0 μmol／L 3.9 ±1.1 4.6 ±1.6 5.1 ±1.7 8.9 ±2.1 11.9 ±1.9 0.624 1.026 3.653 6.311 0.283 0.181 0.011 0.002

2.3 OPD′對心肌細胞周期的影響

流式細胞儀檢測H9c2細胞周期發現，5 μmol／L組和10 μmol／L 組 G0／G1期所占比例分別為（48.7 ±0.3）%和（61.4 ± 0.5）%，與對照組的（32.0 ± 0.4）%比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。而 5 μmol／L 組和 10 μmol／L組G0／G1期所占比例與對照組相比，差異無統計學意義（P ＞ 0.05），詳見表 2。提示 5 μmol／L 及以上濃度的OPD′可將心肌細胞阻滯于G0／G1期，進而造成心肌細胞周期失調。

表2 OPD′對心肌細胞周期的影響（%）

2.4 OPD′對心肌細胞線粒體膜電位的影響

流式細胞儀檢測OPD′對心肌細胞H9c2線粒體膜電位的影響，與對照組相比，OPD′0.1 μmol／L 組和0.5μmol／L 組細胞線粒體膜電位無明顯差異（P＞0.05），而 5 μmol／L 組和 10 μmol／L 組細胞線粒體膜電位明顯下降（P ＜0.01）。詳見表 3。

表3 OPD′對心肌細胞線粒體膜電位的影響（±s）

表3 OPD′對心肌細胞線粒體膜電位的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01。

組別對照組OPD′組 0.1 μmol／L 0.5 μmol／L 5.0 μmol／L 10.0 μmol／L MMP（FI）1.21 ± 0.37 0.95 ± 0.12 0.73 ± 0.21 0.41 ±0.14*0.09 ±0.03*t值P值1.157 1.954 3.503 5.226 0.156 0.061 0.012 0.003

3 討論

本研究結果顯示，OPD′濃度超過 5 μmol／L 時，H9c2細胞存活率明顯下降，凋亡率明顯下降，線粒體膜電位下降；且OPD′可阻滯H9c2細胞由G0／G1期進入S期，使心肌細胞周期失調。提示OPD′對大鼠H9c2細胞有明顯細胞毒性，可能是通過刺激凋亡通路活化而發揮作用的。線粒體膜電位的降低，是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，是細胞早期凋亡的重要指標［6］。在凋亡信號的刺激下，線粒體的膜電位丟失，線粒體的通透性發生變化，線粒體產生三磷酸腺苷（ATP）的能力降低，無法維持其正常功能對細胞供能，細胞就會發生凋亡［7］。另一方面，熱休克蛋白Hsp90作為心臟保護蛋白ErbB2的分子伴侶，可通過與ErbB2結合發揮保護心臟的作用，而ATP的減少會降低Hsp90對ErbB2的親和力，其對心臟的保護作用也會下降［8］。可見，OPD′可能通過影響高能磷酸池對心肌細胞產生細胞毒性作用。

麥冬含多種甾體皂苷，具有抗疲勞、清除自由基、提高細胞免疫功能及降血糖的作用［9］。麥冬有鎮靜、催眠、抗心肌缺血、抗心律失常、抗腫瘤等作用，尤其對增進老年人健康具有多方面功效［10］。目前，對麥冬的藥理活性方面的研究主要集中于其粗提物，對其中單體化合物研究較少。OPD和OPD′作為麥冬的主要成分，結構十分相似，差異僅為糖基側鏈取代不同，OPD含有巖藻糖取代基而OPD含葡萄糖取代基［11］。對于OPD的研究相對較多：OPD可通過降低阿霉素誘導的活性氧簇（ROS）累積，進而緩解內質網應激而對心肌產生保護作用［4］；OPD可通過抑制內質網應激及其介導的細胞凋亡通路減輕大鼠心肌細胞的凋亡［12］；另外，OPD可通過降低自噬抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥大［5］。OPD對心肌細胞的損傷、肥大均有保護作用，本研究中發現OPD′卻對心肌細胞產生細胞毒性作用。OPD與OPD′同為參麥注射液成分，參麥注射液可增加機體耐缺氧能力，減少心肌耗氧量，并有保護、修復心肌細胞的作用［13-15］，而其不良反應可能與OPD′的細胞毒性相關。

綜上所述，一定濃度的OPD′對心肌細胞有促進凋亡作用，會干擾細胞周期，有一定細胞毒性。通過與OPD功能的對比發現，可通過優化OPD′結構的方式對藥物進行改良，但OPD′的具體作用機制和其在機體內的轉化機制還需要作進一步研究。