高效液相色譜法測定逍遙分散片中甘草苷含量

趙 準，季玉林，吳建明，趙 環，丁京偉，麻家佳，章旭飛，雷火娟，鄧海珍

（浙江維康藥業股份有限公司，浙江 麗水 323000）

逍遙分散片配方起源于逍遙片［1］，由柴胡、炙甘草、白芍、當歸、炒白術等8味中藥組方，功能主治為疏肝健脾、養血調經，用于肝郁脾虛所致的郁悶不舒、胸脅脹痛、頭暈目眩、食欲減退、月經不調。中藥分散片同時具備液體制劑和固體制劑的獨特優勢，分散度大，溶出迅速，生物利用度高，制備方法簡單、易行，是應用前景廣闊的中藥口服新劑型［2-3］。炙甘草具有鎮痛、鎮咳平喘、抗心律失常、抗炎、調節免疫等功效，與白芍配伍有加強解痙作用［4-10］。炙甘草中的甘草苷是甘草中重要的黃酮類化合物，具有抗潰瘍、解痙、鎮痛等作用。為了更好地控制逍遙分散片的質量，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定甘草苷含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括G1311A泵，G1329A進樣器，G1314B檢測器，G1316A柱溫箱，美國安捷倫公司）；BS124S型電子分析天平（檢測精度為0.1‰，德國賽多利斯股份有限公司）；KQ-500DB型超聲波清洗器（功率500 W，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

甘草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，質量分數以93.1%計，批號為111610-201607）；逍遙分散片（浙江維康藥業股份有限公司，批號分別為B170501，B170502，B170503）；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技公司，批號為 17065013，純度為 99.9%）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技公司，批號為174488，純度為99.9%）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號為20180116，純度≥99.5%）；純化水（浙江維康藥業股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：AgilentSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈 -0.05%醋酸溶液（10 ∶90）；柱溫：30 ℃；檢測波長：276 nm；流速：1.0 mL ／min。理論板數按甘草苷峰計應不低于4 000。在此條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取甘草苷對照品13.95 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液2 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1 mL含甘草苷 10.39 μg）。取本品 20 片，研細，取 1.0 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入70%乙醇至刻度，超聲處理30 min，放冷，再加70%乙醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。取按樣品制備工藝制備的缺炙甘草陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液各10 μL，進樣測定。結果陰性對照品溶液色譜中，在與對照品溶液及供試品溶液色譜峰相應處無甘草苷峰出現，表明陰性對照無干擾，專屬性良好（見圖1）。

線性關系考察：精密量取2.2項下對照品貯備液0.4，0.8，1.0，2.0，2.5，3.0，4.0 mL，分別置 50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按擬訂色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝1.303×103X＋0.636 1，r＝0.999 9（n＝7）。結果表明，甘草苷進樣量在 0.020 78 ～0.207 80 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2項下對照品溶液10 μL，連續進樣5次。結果甘草苷峰面積的RSD為0.65%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品（批號為B170501）溶液適量，分別于室溫下放置 0，4，8，12，16 h，按擬訂色譜條件進樣，記錄峰面積。結果甘草苷峰面積的RSD為0.80%（n＝5），表明供試品溶液在16 h內穩定。

重復性試驗：取同一樣品（批號為B170501）適量，研細，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結果甘草苷平均含量為 0.518 mg／g，RSD為1.14%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取6份已知含量的樣品（批號為B170501）約 0.5 g，精密穩定，分別精密加入 2.2 項下對照品貯備液1.0 mL，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 甘草苷加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取逍遙分散片3批，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分析，按外標法以甘草苷峰面積計算含量。結果批號分別為B170501，B170502，B170503的3批樣品中甘草苷含量分別為 0.518，0.523，0.519 mg／g。

3 討論

參考文獻［11-14］，曾考察乙腈 -0.05%醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸、甲醇-0.5%冰醋酸、乙腈-水5個流動相系統，結果表明，采用乙腈-0.05%醋酸溶液為流動相，反復調整比例，在比例為10∶90條件下，色譜圖分離效果好，干擾小。最后選定流動相為乙腈-0.05%醋酸溶液（10∶90）。

曾考察50%甲醇、甲醇、70%乙醇提取溶劑，超聲提取、加熱回流提取方法及20，30，40 min超聲提取時間對結果的影響，結果表明30 min后測定值達到穩定值，超聲提取和回流提取所得甘草苷含量非常接近，但超聲提取比回流提取更簡便、快捷。用70%乙醇方法提取效果較好，提取較完全，且雜質峰相對較少。故以70%乙醇為提取溶劑，超聲30 min。

曾考察3種不同廠家的色譜柱［Agilent SB-C18柱（250 mm ×4.6mm，5 μm）；YMC-ODS 柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）；Phenomenex-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）］，考察了方法耐用性，分離度、理論板數均能滿足系統適用性的要求，綜合對稱因子等各種因素，選擇Agilent SB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）為色譜柱。

綜上所述，所建立的HPLC法操作簡單，結果準確可靠，可用于逍遙分散片中甘草苷的含量測定。