桔梗皂苷D協同多西他賽促進侵襲性前列腺癌細胞PC3的凋亡*

葛東升 朱麗莉 王鶯語 羅 嘉 吳國勝** 馮寧翰, **

1. 南京醫科大學附屬無錫第二醫院泌尿外科（江蘇 214002）2. 江南大學無錫醫學院

內分泌的去勢治療（androgen deprivation therapy，ADT）是目前前列腺癌主要的治療方法，大多數患者早期對其比較敏感，但經過1～2年治療后，最終會進展為去勢抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC），這類前列腺癌預后較差，是臨床治療的難點[1]。

多西他賽（docetaxel, DTX）是半合成紫杉醇的衍生物, 也是一種典型的細胞毒性藥物，具有廣譜高效的抗腫瘤活性。它可通過加強微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，使細胞形成穩定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細胞的有絲分裂,并阻滯細胞于G2/M期，最終導致腫瘤細胞凋亡。同時，DTX可以誘導腫瘤細胞中抑制凋亡的B細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）磷酸化、提高游離BAX（Bcl-2 Associated X Protein, BAX）蛋白水平并最終促進細胞凋亡。DTX在1998年獲美國FDA批準上市，是被FDA批準用于治療CRPC的首個藥物，以其為主的抗腫瘤藥物聯合治療是目前CRPC治療標準方案。

桔梗皂苷D（Platycodin D, PD）是從桔梗中提取的活性成分，它具有免疫刺激、抗炎、止痛、抗肥胖和抗動脈粥樣硬化等功能[2-4]。還可以通過誘導細胞自噬抑制腫瘤細胞生長，如白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌以及前列腺癌[5]。

基于上述研究基礎，我們提出PD與DTX聯合應用治療非雄依賴的前列腺癌的設想。本研究選取非雄激素依賴的細胞株PC3細胞，通過體外細胞培養觀察PD及DTX單獨及聯合應用對PC3細胞增殖和凋亡的影響，并進一步探討其內在分子機制，以明確PD聯合DTX對非雄激素依賴前列腺癌的潛在治療效果。

材料和方法

一、材料

PD為澳門大學中華醫藥研究院陸金鍵博士饋贈，將PD粉末完全溶于二甲基亞砜，配制為20 mmoL溶液。DTX購于江蘇恒瑞醫藥有限公司，將DTX用二甲基亞砜稀釋1000倍，得到濃度為49.5 nmoL溶液。多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）、凋亡相關蛋白（Cleaved PARP）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR，ser2448）、磷酸化表皮生長因子受體（p-EGFR，tyr1068）、Bcl-2、BAX、酵母Agt-6同系物（Beclin-1）、自噬相關蛋白-5（Autophagy-related protein-5，Agt-5）、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ（microtubuleassociatedprotein1 light chain 3-Ⅰ/Ⅱ, LC3-Ⅰ/Ⅱ）以及β微管蛋白（β-tubulin）均購自美國Cell Signaling Technology公司。蛋白定量試劑盒（BCA試劑盒）購自美國Thermo Fisher Scienti fi c公司。噻唑藍（MTT），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）購自上海碧云天生物技術有限公司。細胞凋亡檢測試劑盒（FITC-Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）購于美國BD pharmingen公司。

二、細胞培養

PC3購于美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC），用RPMI-1640完全培養基（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）培養。細胞培養條件為37℃，5% CO2，飽和濕度培養。根據細胞生長情況，每2～4天傳代一次。

三、MTT法細胞增殖抑制試驗

取對數生長期細胞，均勻種入96孔板，每個孔約為10 000個細胞，培養24h完全貼壁后，按照每個濃度設4個平行孔，將孔板分為4組，第四組作為對照組，先向第一、三組加入PD濃度為2.5 μmoL、5 μmoL、10 μmoL、20 μmoL、40 μmoL和80 μmoL的預配好的培養基，培養6h后， 棄去細胞上層藥液，向第一組加入完全培養基，第二和第三組分別加入DTX濃度為2.5 nmoL、5 nmoL、10 nmoL、20 nmoL、40 nmoL和80 nmoL的預配好的培養基，繼續培養24h，棄去培養基，加入用培養基稀釋至1mg/mL的MTT溶液，放入培養基中培養4h，小心吸棄上清，向每個孔加入二甲基亞砜150 μL溶解甲臜晶體，采用BioTek Synergy H4 全功能微孔板檢測儀在波長490 nm處檢測各孔吸光度（OD）值，并計算藥物對細胞生長的抑制率。

四、Western blot

將PD和DTX處理好的細胞用PBS洗兩次，加入適量細胞裂解液，刮下細胞，移入1.5 mL EP管中，超聲破碎，然后冰上孵育20min，之后于4℃，4 000×g離心20 min，取上清，得到細胞總蛋白，用BCA法測蛋白濃度，蛋白樣品上樣量為每孔30 μg。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后將分離后的蛋白電轉移印跡到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST洗3次，每次10min，放入相應抗體中（體積稀釋比例都是1：1000），4℃搖床上孵育過夜，TBST洗膜后，于辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1：2000）室溫孵育1h，TBST洗3次，每次10min。然后用ECL試劑盒曝光顯色。

五、DAPI 染色

將經過PD和DTX處理好的細胞吸棄培養基，PBS洗兩次，每個孔加入800 μL多聚甲醛固定，10min后吸棄上清，用PBS洗兩次，避光，加入配置好的DAPI溶液，并將孔板用錫紙嚴密包好，置于水平搖床孵育10min，用ZEISS全自動正置熒光顯微鏡進行熒光拍照。

六、流式細胞儀檢測細胞凋亡率

將六孔板中用PD和DTX處理好的細胞全部分別收集至15mL離心管（包括上清中的細胞和PBS洗下的細胞），200×g，4℃離心5min，用預冷的PBS洗兩次，于100 μL 的1×Binging Buffer中重懸，每個樣品中加入5 μL 依賴性磷脂結合蛋白（FITCAnnexinV）和5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）避光染色30min，用流式細胞儀分析細胞的凋亡情況。

七、統計學方法

運用SPSS 13.0軟件對實驗數據進行統計學分析和檢驗。所有實驗重復3次，多個組別間比較運用單因素方差分析（One-way ANOVN）。數據以均數±標準差（±s）表示。P＜0.05被認為差異具有統計學意義。

結 果

一、PD和DTX協同抑制PC3細胞的生長

PD和DTX均能抑制PC3細胞的生長，且PD呈現出明顯的劑量依賴性（圖1）。在PD和DTX聯合作用之后可以顯著抑制PC3細胞生長。圖1A為聯合用藥的加藥方案，即在PD作用6h之后撤藥，然后加入DTX繼續作用24h，單獨用藥為PD組只加PD處理6h，DTX組只用DTX處理24h。圖1B為不同濃度的PD和DTX作用于PC3，對其增殖的影響，表1顯示在PD和DTX濃度分別在2.5 μmoL和2.5 nmoL，5 μnmoL和5 nmoL，10 μmoL和10 nmoL，20 μmoL和20 nmoL時聯合用藥對PC3細胞增殖具有協同抑制作用，且在20 μmoL PD和20 nmoL DTX聯合使用時，協同作用最為顯著，與PD組相比差異具有顯著統計學意義（P＜0.001），與DTX組相比差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 比較PD、DTX單獨和聯合用藥對PC3細胞的生長抑制作用

表1 PD和DTX對PC3的抑制率以及協同系數

二、 PD和DTX聯合用藥促進PC3細胞凋亡

PC3細胞種于六孔板中，分別以20μmoL PD處理6h，20nmoL DTX處理24h以及20μmoL PD處理6h后撤藥再用20nmoL DTX處理24h，觀察細胞形態學變化，進行DAPI染色，凋亡率檢測，以及凋亡相關蛋白的表達情況。

觀察PD，DTX和PD聯合DTX，對PC3細胞形態的影響，由圖2A可見，PD和DTX均可導致細胞形態發生一定程度的變化，在PD聯合DTX用藥中發現細

胞形態發生明顯變化，絕大多數細胞由梭形變為圓形，并且內部產生空泡狀結構，貼壁細胞數量也有所降低。在圖2B中能觀察到PD、DTX和PD聯合DTX作用于PC3細胞的DAPI染色結果，DAPI作為一種DNA染料，可以檢測細胞凋亡，對照組和PD組染色核形完整，染色質均勻，說明未發生凋亡；DTX組中發現少量的細胞核固縮，說明有部分細胞發生了早期凋亡；而在PD和DTX聯合用藥組發現細胞核進一步固縮，形成顆粒物，甚至細胞核破裂形成碎片，說明多量的細胞發生凋亡。 為進一步明確PC3細胞的凋亡率，運用流式細胞技術對PD，DTX和PD聯合DTX作用過的PC3細胞進行AnnexinV和PI雙染，然后運用流式細胞儀進行檢測，如圖2C所示，PD和DTX聯合用藥組凋亡率均高于PD和DTX單獨用藥組。并且在Western blot的結果顯示（圖2D），在PD和DTX聯合用藥組中Cleaved PARP表達量顯著增高，說明PD聯合DTX作用于PC3細胞可以顯著增加PC3細胞凋亡。

三、PD聯合DTX協同誘導PC3細胞凋亡的機制

PD可以誘導多種腫瘤細胞發生自噬[5]，在圖2A中，PD組細胞產生多量空泡狀結構，推測PD和DTX聯合使用的協同效應可能與PD誘導PC3細胞發生自噬有關，在圖3A中，PD組以及PD和DTX聯合用藥組LC3-II表達量較其他組增多，表明在PD處理6h后PC3細胞已經發生自噬。在圖3B中，DTX組和PD聯合DTX組均可導致p-mTOR（ser2448）和p-EGFR（tyr1068）表達量明顯減低，這可能與細胞發生凋亡的具體機制相關。

圖3 PD和DTX對PC3細胞凋亡機制的探究

討 論

前列腺癌是男性前列腺泡或導管上皮來源的惡性腫瘤，其發病率具有明顯的地理和種族差異。在歐美等發達國家和地區，它是男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率居各種癌癥的第二位；在亞洲尤其是我國，前列腺癌發病率雖低于西方國家，但近年來呈顯著增長且年輕化趨勢[6,7]。目前認為，前列腺癌發病率的持續增高和遠處轉移依賴于雄激素受體傳導信號，因此ADT療法是除外科手術與放射治療外的標準前列腺癌治療方法，可以暫時抑制前列腺癌細胞的生長，延緩疾病的惡化進展。盡管80%～90%的早期前列腺癌患者都會對ADT治療有效果，但幾乎所有患者都會在1～2年內復發并由雄激素依賴性前列腺癌發展成高度惡化且廣泛轉移的雄激素非依賴性前列腺癌，使常規的ADT療法失去效果，成為臨床治療的難點。目前臨床用于治療前列腺癌的藥物雖已顯示出強大的功效，但也存在一些弊端，單獨用藥劑量大、副作用大（如耐藥性、不良反應等），而且抗癌治療藥物一般價格昂貴，大大增加了患者的醫療負擔。因此，發現新的高效藥物成為現階段臨床治療亟待解決的問題。有鑒于此，本研究試圖從藥物協同作用入手，將傳統中藥有效成分與臨床一線化療藥物結合，優化治療方案，降低治療成本，提高治療效果，探索前列腺癌疾病新的藥物治療策略。

紫杉烷是一種典型的細胞毒藥物，具有高效廣譜的抗腫瘤活性，可與微管蛋白的亞基結合抑制微管動力學，誘導腫瘤細胞發生G2/M期周期阻滯[8]，亦可通過激活多條信號轉導通路誘導腫瘤細胞發生凋亡[9-12]。DTX是第2代紫杉烷衍生物，由歐洲紅豆杉提取的非細胞毒性前體化合物10-脫乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB Ⅲ）經半合成而成，1998年獲美國FDA批準上市[13]。與紫杉醇相比，DTX有更強的微管蛋白親和力和更長的細胞內停留時間，對腫瘤細胞的破壞力更強。它有一定的靶向性和具有減少藥物劑量、降低毒副作用，尤其是減少過敏反應發生的特點。然而因患者自身耐受差、藥物選擇性弱等原因亦導致化療失敗或復發，使其療效欠佳。因此，為降低DTX的毒副作用，增強其療效，尋找有效的輔助治療藥物成為亟待解決的關鍵問題。

桔梗，俗稱氣球花，是一種傳統中草藥，味苦、辛，平。歸肺經。其主要功能為宣肺，利咽，祛痰和排膿。在中國、日本及韓國桔梗被廣泛用作飲食來源以及治療呼吸系統疾病的藥物。PD是從桔梗中提取的活性成分，它具有免疫刺激、抗炎、止痛、抗肥胖和抗動脈粥樣硬化等功能[2-4,14-16]。Chun等通過對人胃癌細胞（AGS）的研究表明，PD可顯著性地抑制其增殖并介導失巢凋亡，這種細胞凋亡與外源性的Fas受體通路及內源性的線粒體Bcl-2家族通路有關[17]；同時，PD介導的p38等應激活化蛋白激酶的磷酸化可能是其引起AGS凋亡的一個原因。Kim等通過研究人白血病細胞（U937,THP-1及K562），發現PD可在體外抑制白血病細胞的增殖，并介導其凋亡，其機制是為降低c-Myc和Spl蛋白的表達水平，并下調其與DNA的結合能力，通過Ark途徑抑制hTERT的磷酸化和核轉位，發揮抑制細胞增殖的作用[18]；此外，Shin等報道，PD通過抑制Egr-1的活化、ROS的產生、MMP的分解，及活化Caspase-3，在誘導人白血病細胞（U937）凋亡的過程中發揮作用[19]。近年來，有許多研究表明PD在誘導細胞自噬中也發揮重要作用，如PD能夠誘導人肝癌細胞BEL-7402形成脂質空泡，提高細胞內自噬標志物LC3-Ⅱ水平，使細胞自噬[20]；在非小細胞肺癌中，PD可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑并激活JNK和p38-MAPK信號傳導途徑誘導自噬[21]。本研究中，在PD處理細胞6h后可以發現細胞出現了明顯的自噬（圖2A和圖3A），符合上述文獻的報道。在后續DTX處理24h后，明顯促進了DTX介導的凋亡。基于此結果，我們推斷PD介導的PC3自噬使細胞處于應激狀態，腫瘤細胞通過自噬的作用一方面提供細胞生長的能量物質，另一方面保證細胞的存活。在此基礎上，加入細胞毒藥物DTX打破了細胞內部的能量平衡，使細胞更傾向于發生凋亡。在具體分子機制研究方面，我們檢測了與細胞能量代謝相關的EGFR和mTOR的激活情況，發現聯合用藥后，進一步抑制了相關信號通路，具體機制仍需進一步闡明。

總之，通過本研究，我們揭示PD與DTX協同作用這一用藥方案對誘導前列腺癌細胞凋亡的優勢，進一步挖掘了傳統中藥中的單體化合物通過協同用藥在前列腺癌治療中的潛力，為有效醫治前列腺癌提供新的藥理學參考。