不同生長速率肉雞腸道真菌結構分析

溫雪婷，朱江群，朱建芬，肖英平，李娜，楊華*

(1.浙江農林大學 動物科技學院，浙江 杭州 311300； 2.余杭區余杭街道農業公共服務中心，浙江 杭州 311100； 3.余杭區塘棲鎮農業公共服務中心，浙江 杭州 311106； 4.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021)

動物腸道內寄居著大量共生微生物，包括真菌、細菌、古菌及病毒，其中真菌是腸道菌群的重要組成部分，結構受日齡、性別、飼糧、品種、地域、藥物、疾病等因素的影響[1]。與其他腸道菌相比，腸道真菌的豐度和多樣性較低，存在明顯的個體差異[2-3]，且其組成并不穩定，不同時間真菌組成相似性低[4-6]。由于真菌在腸道中的豐度低、含量少，因此通用引物擴增真菌DNA時會出現陰性結果，在某種程度上限制了腸道真菌的研究。

在正常情況下，腸道內細菌、病毒和真菌菌群之間存在穩定的對抗、協同或共生關系[7-8]。腸道中真菌多樣性分布可能是飲食和環境因素的體現，同時也是真菌菌群同宿主腸道免疫系統，以及土著微生物與外源真菌之間相互作用的體現。真菌可通過與細菌的相互作用從而改變腸道生物屏障[9-10]，引起腸道通透性增加，導致腸腔內真菌易位到腸腔以外部位并引起侵襲性感染。消化道真菌感染可由腸道正常真菌菌群或是外來的致病菌引發，真菌性食管炎及胃炎的主要致病菌為白色念珠菌，毛霉菌屬、念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等可導致腸道的真菌性炎癥[1,11]。不同腸段優勢真菌與真菌結構不同[12]，研究還發現人類肥胖組與非肥胖組的腸道真菌多樣性存在差異，肥胖組的真菌多樣性較非肥胖組降低，毛霉菌在非肥胖組中檢測率最高，毛霉屬的相對豐度與體質量降低程度呈正相關[13-14]。

本研究旨在利用高通量測序技術比較不同生長速率肉雞盲腸真菌組成差異，探索肉雞腸道真菌結構與雞生長速率的關系，為正確定義“肉雞健康腸道真菌菌群”提供更多理論數據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與采樣

選擇10 000只羅斯308肉雞常規飼養。1～2日齡時，提供24 h的光周期，飼養溫度32～34 ℃；隨后提供16 h的光周期，溫度每周減少2～3 ℃，至20 ℃。所有肉雞飼喂相同配合飼料，隨意采食[15]。38日齡時，從中隨機挑選600只公雞，選取其中體質量最高的8只作雞H組，(3 146.25±92.57)g，體質量中等的8只雞作M組，(2 212.5±14.88)g和體質量最低的8只雞作L組，(1 127.5±93.16)g。頸椎脫位處死，屠宰后立刻取其盲腸內容物，標記為H1～H8、M1～M8和L1～L8，液氮冷凍，-80 ℃儲存待測。

1.2 DNA提取、擴增與高通量測序

使用DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取樣本DNA，并存儲于-80 ℃。以提取的DNA為模板，使用ITS2引物ITS3-2024F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4-2409R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對細菌進行PCR擴增，擴增產物進行ITS測序分析，由llumina HiSeq 2500平臺測序[4]。

1.3 序列分析與系統分類

采用QIIME軟件(V1.7.0)進行序列的質量控制及過濾，剔除低質量的DNA序列。在QIIME中調用uCLUST對優質序列按相似度97%進行聚類，定義為操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。利用聚類 OTUs 構造稀釋曲線，并用 QIIME計算各樣品的α多樣性指數(ChaoⅠ、ACE、Simpson、 Shannon和覆蓋度指數)，并用R軟件包(Version 2.15.3)顯示。使用Sliva和RPD數據庫對所有OTU的代表性序列進行物種匹配，在門和屬的水平上對樣品的真菌組成進行統計，得到菌群分布結果，并繪制柱狀圖。進行主坐標分析(PCoA)和聚類分析，對樣本間物種多樣性差異進行分析。

2 結果與分析

2.1 α多樣性

通過Chao1豐富度估計量、ACE指數計算菌群豐度，香農多樣性指數(Shannon diversity index)、辛普森多樣性指數(Simpson diversity index)計算菌群多樣性，覆蓋率指數(Coverage index)刻畫序列深度(表1)。研究發現，最低體質量組雞盲腸內容物真菌豐度最高(Chao1：451.352，ACE：438.521)，最高體質量組雞盲腸內容物菌群多樣性最高(Shannon指數：4.413，Simpson指數：0.838)。所測樣品覆蓋率指數均超過99.8%，表明本次測序結果能夠代表樣本的真實情況。

表1 各供試組的α多樣性指數

2.2 腸道真菌菌群結構分布

稀釋曲線用于評價測序量是否足以覆蓋所有類群，并間接反映樣品中物種的豐富程度。取樣943 0 reads，隨著取樣reads的增加，新發現的OTUs減少，取樣565 80 reads時，稀疏曲線趨于飽和(圖1)。這表明，樣本庫的大小足以估計相似閾值97%的菌種豐度和真菌群落多樣性。

圖1 腸道真菌菌群結構分布的稀疏曲線

研究發現，所有序列可分為5個門：球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)(圖2)。豐度最高的10個屬分別為念球菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、曲霉屬(Aspergillus)、哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、赤霉菌屬(Gibberella)、微囊菌屬(Microascus)、Phialemoniopsis、鏈格孢屬(Alternaria)和木霉屬(Trichoderma)。在門水平上，子囊菌門為優勢菌門；在屬水平上，不同組腸道真菌沒有明顯的規律，樣本間個體差異大。

2.3 菌群聚類分析和主坐標分析

為了對各組腸道真菌群落進行比較，進行聚類分析與主坐標分析(PCoA)。聚類分析根據OUT數據進行標準化處理后，選取數目最多的35個菌屬，基于R熱點圖進行作圖，熱圖中的每1個色塊代表1個樣品在1個屬水平上的豐度。不同分組橫向排列，屬縱向排列，對樣品進行聚類，從聚類中可以了解樣品之間的相似性以及屬水平上的群落構成相似性(圖3)。研究發現，最低體質量組腸道真菌豐度較高的有德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、小囊屬(Microascus)、毛霉菌(Mucor)等。

圖2 不同樣品中真菌群落組成

圖3 真菌結構的熱點

主坐標分析PCoA沒有改變樣品點之間的相互位置關系，只是改變了坐標系統。通過PCoA可以觀察個體或群體間的差異。每1個點代表1個樣本，相同顏色的點來自同1個分組，兩點之間距離越近表明兩者的群落構成差異越小(圖4)。研究發現，最低體質量組與最高體質量組肉雞腸道真菌群落構成差異較大，最低體質量組與中等體質量組、中等體質量組與最高體質量組肉雞腸道真菌群落構成差異較小。最低體質量組與中等體質量組組內個體差異較最高體質量組小。

圖4 菌群的主坐標分析

3 小結

肉雞腸道真菌序列聚集成2 759個OTUs，分為5個菌門：球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)。豐度最高的10個屬分別為念球菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、曲霉屬(Aspergillus)、哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、赤霉菌屬(Gibberella)、微囊菌屬(Microascus)、Phialemoniopsis、鏈格孢屬(Alternaria)和木霉屬(Trichoderma)。α多樣性指數表明，最低體質量組真菌的豐度最高，其次為中等體質量組和最高體質量組；最高體質量組的菌群多樣性最高，其次為中等體質量組和最低體質量組。肉雞腸道優勢菌門為子囊菌門，屬水平上腸道真菌有較大的個體差異。最低體質量組與最高體質量組肉雞腸道真菌群落構成差異較大。已知曲霉菌、毛霉菌可導致腸道真菌性炎癥，毛霉屬的相對豐度與體質量降低程度呈正相關[13]，通過熱點圖可知，最低體質量肉雞腸道組曲霉菌屬(Aspergillus)、毛霉菌(Mucor)豐度較高。