高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的方法優(yōu)化

◎ 王嘉權(quán)，劉成文

（龍崗區(qū)水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心，廣東 深圳 518000）

諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星同屬于喹諾酮類抗生素，是一類人畜通用的藥物。其因具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性和毒副作用小等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中，包括在雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、魚、蝦和蟹等的養(yǎng)殖中用于疾病防治。喹諾酮類抗生素具有抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)、作用迅速、體內(nèi)分布廣泛及與其他抗生素之間無交叉耐藥性等特點(diǎn)，預(yù)防和治療畜禽的細(xì)菌性感染及支原體病有良好的效果[1-2]。該類藥物的不良反應(yīng)主要有：①胃腸道反應(yīng)。惡心、嘔吐、不適、疼痛等。②中樞反應(yīng)。頭痛、頭暈、睡眠不良等，并可致精神癥狀。③該類藥物可抑制γ-氨基丁酸（GABA）的作用，因此可誘發(fā)癲癇，有癲癇病史者慎用。④影響軟骨發(fā)育，孕婦、未成年兒童應(yīng)慎用。⑤可產(chǎn)生結(jié)晶尿，尤其在堿性尿中更易發(fā)生。⑥大劑量或長期應(yīng)用本類藥物易致肝損害。

目前，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星常用的液相色譜檢測方法有農(nóng)業(yè)部783號公告-2-2006，但該方法的前處理過程繁瑣，加標(biāo)回收率低。本文對該方法的前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，特點(diǎn)是用自制的無水硫酸鈉柱進(jìn)行凈化處理。最終結(jié)果回收率和精密度都能達(dá)到檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

1.1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀配2475熒光檢測器，色譜柱SunFireTMC18，分析天平，旋渦振蕩器，高速冷凍離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.1.2 試劑

乙腈（色譜純），正乙烷(分析純)，四丁基溴化銨(分析純)，鹽酸(分析純)，無水硫酸鈉（分析純，經(jīng)640℃灼燒4 h后存于密閉容器中備用），諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度高于99%）。

1.1.3 試劑配制

①酸化乙腈：乙腈∶50%鹽酸水溶液（10 000∶8）。②四丁基溴化銨溶液：精確稱取3.22 g四丁基溴化銨，用水溶解磷酸調(diào)pH到3.1并定容至1 000 mL，過0.45 μm濾膜。③流動(dòng)相：四丁基溴化銨溶液∶乙腈=95∶5。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

用流動(dòng)相分別配制濃度為5、10、20、50、100μg·L-1和 200 μg·L-1。

1.1.5 自制無水硫酸鈉柱

準(zhǔn)備20 mL注射器、分析濾紙和已經(jīng)灼燒后的無水硫酸鈉，將濾紙剪成注射器口徑大小（如圖1），再將剪好的濾紙放到注射器的最底部，最后將無水硫酸鈉放進(jìn)注射器內(nèi)（如圖2），自制無水硫酸鈉柱完成。

圖1 制作前準(zhǔn)備的材料圖

圖2 完成后的無水硫酸鈉柱圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加5～6粒玻璃珠，加入20 mL酸化乙腈后立即振蕩（防止樣品結(jié)塊），再加入10 mL正己烷振蕩，以4 000 r·min-1離心5 min，去上層取下清層過自制無水硫酸鈉柱。再加入20 mL酸化乙腈和10 mL正己烷再提取一次，去上層取下清層過自制無水硫酸鈉柱，再加10 mL酸化乙腈沖洗自制柱。收集液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用2 mL流動(dòng)相充分溶解定容后，10 000 r·min-1高速冷凍離心5 min，下清液過0.45 μm濾膜上機(jī)。

1.2.2 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈∶四丁基溴化銨溶液=5∶95；流速：1.5 mL·min-1；檢測波長：激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長450 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 校正曲線及色譜圖

諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星校正曲線如圖3～5所示，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖6所示。

圖3 諾氟沙星校正曲線圖

圖4 環(huán)丙沙星校正曲線圖

圖5 恩諾沙星校正曲線圖

圖6 諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 回收率和精密度

分別在空白的草魚樣品中加入0.250、0.500 mL質(zhì)量濃度為100 μg·L-1的諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.00、10.00μg·kg-1濃度水平），0.100 mL質(zhì)量濃度為1 000 μg·L-1的諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg·kg-1濃度水平)，按本文方法進(jìn)行測定，平行測定6次，方法的回收率在 73.0%～87.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.93%～7.59%，結(jié)果見表1。

表1 樣品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的加標(biāo)回收率以及精密度表

從結(jié)果表1可以看出，使用本文優(yōu)化后的方法進(jìn)行檢測，諾氟沙星的回收率為78.2%～87.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.93%～6.95%；環(huán)丙沙星的回收率為75.0%～82.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.93%～7.54%；恩諾沙星的回收率為73.0%～84.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差5.93%～7.59%。符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

本方法的特點(diǎn)是使用了自制的無水硫酸鈉柱對樣品進(jìn)行吸水和凈化，與農(nóng)業(yè)部738號公告-2-2006標(biāo)準(zhǔn)方法相比起來步驟更為簡便，減少在實(shí)驗(yàn)中提取液轉(zhuǎn)移的次數(shù)，從而既能降低時(shí)間成本又能保證較高的回收率，提高檢測效率。本次試驗(yàn)結(jié)果證明，優(yōu)化后的檢測方法能滿足日常檢測工作需求，可用于水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星藥物殘留量的測定。