環氧基修飾磁性微球固定化磷脂酶A1

鮑 賽，操麗麗，龐 敏，潘麗軍，侯志剛，水龍龍，李進紅，姜紹通

（合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

磷脂酶A1（phospholipase A1，PLA1）（Lecitase?Ultra）是一類能特異性水解磷脂Sn-1位酰基生成溶血磷脂和脂肪酸的酶，在油脂化學工業中發揮重要作用[1-2]。然而，游離PLA1存在價格昂貴、穩定性差和難以從反應體系分離與回收等缺點，限制了它的工業化應用[3]。對PLA1固定化能很好地解決上述問題。酶的固定化技術是指利用物理或化學手段將酶限制或束縛在載體上，但酶的催化特性得以保留和穩定性得以提高的一門技術[4]。

Fe3O4磁性微球由于具備超順磁性、高比表面積、低毒性以及優良的生物相容性等優勢而成為酶固定化的重要載體[5-6]。然而，Fe3O4磁性微球表面除少量羥基外沒有活潑的官能團與酶分子發生共價反應，且裸露的Fe3O4磁性微球在空氣中易被氧化，在Fe3O4磁性微球表面進行化學修飾引入合適的活潑基團能改進這些不足，更好地用于酶的固定化[7]。

環氧基團在中性條件下非常穩定，即使是在潮濕的環境中也可以長期貯存[8]。據報道，它們在堿性或酸性條件下，能通過多點共價固定化酶[9]。因此，環氧基修飾的Fe3O4磁性微球是一種非常理想的固定化酶載體，已經被廣泛應用于各種酶的固定化，如脂肪酶[10]、馬肝醇脫氫酶[11]和青霉素G酰化酶[12]，但固定化PLA1還鮮有探討。本研究利用自制的環氧基修飾的Fe3O4磁性微球為載體固定PLA1，采用響應面法優化PLA1的固定化條件，并考察其酶學性質和載體的結構組成特性，以期為后續研究酶法脫膠和工業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PLA1（Lecitase?Ultra） 丹麥諾維信公司；γ-（2,3-環氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（γ-glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS） 上海阿拉丁有限公司；大豆卵磷脂（粉末狀） 上海藍季科技發展有限公司；FeCl2·4H2O、無水FeCl3、乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸、聚乙烯醇、氫氧化鈉、氟化鈉、丙酮、考馬斯亮藍（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nicolet67傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；D/MAX2500V X射線衍射儀 日本理學株式會社；SU8020冷場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立公司；JEM-1011透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）日本電子公司；T6新世紀型紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；DZJ-4B自動電位滴定儀上海儀電科學儀器股份有限公司；DZF-6053真空干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；FA25高剪切分散乳化機上海弗魯克流體機械制造有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠；NSKY-110WX型水浴搖床 上海蘇坤實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4磁性微球的制備

采用傳統的共沉淀法制備Fe3O4磁性微球[13]，整個制備過程在氮氣環境中進行。首先，將FeCl2·4H2O和無水FeCl3按物質的量比1∶2加入100 mL的去離子水中。然后，在室溫下逐滴加入7 mL 30% NaOH溶液同時劇烈攪拌，直至產生黑色沉淀。最后，磁分離，用去離子水洗至pH 7.0，室溫下真空干燥12 h。

1.3.2 GPTMS修飾Fe3O4磁性微球[14]

稱0.5 g制備的Fe3O4磁性微球于20 mL超純水中，超聲分散5 min，稱為A液；稱2.5 g GPTMS于20 mL的超純水中，超聲分散5 min，并用4%的NaOH溶液調節pH值至中性，稱為B液。將A液和B液全部加入100 mL的三口燒瓶中，超聲10 min，再加入5 mL 1%氟化鈉溶液，室溫抽真空減壓3 h，磁分離，用丙酮洗滌若干次后，室溫真空干燥12 h得環氧基修飾的Fe3O4磁性微球（Fe3O4@GPTMS）。

1.3.3 Fe3O4@GPTMS固定化PLA1

為獲得高酶活力和高固定化率的固定化酶制劑，在不同固定化條件如緩沖液pH值、酶液添加量和固定化時間下進行單因素試驗。分別取1～6 mL PLA1和1 g Fe3O4@GPTMS于50 mL緩沖液（0.1 mol/L檸檬酸溶液、0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液按不同比例配成pH值分別為3.0～6.0的緩沖液）中，在室溫（20 ℃）條件下用搖床振蕩固定1～6 h，傾出上清液，用緩沖液沖洗若干次至洗液中無蛋白被檢測出。將固定化酶、上清液和洗液保存于4 ℃冰箱中。

1.3.4 響應面試驗設計

基于單因素試驗結果，以固定化酶活力為指標，通過Box-Behnken設計優化固定化PLA1的條件參數。試驗因素與水平設計見表1。

表1 固定化條件Box-Behnken試驗因素與水平Table1 Factors and their levels used for Box-Behnken design for optimization of immobilization conditions

1.3.5 固定化PLA1的固定化率及酶活力測定

依據Bradford[15]的方法測定蛋白含量，通過測定蛋白含量得到固定化率，見下式。參照文獻[16-17]測定游離PLA1和固定化PLA1活力，相對酶活力是指在同組實驗中，最大值為100%時其他值與最大值的百分比。

式中：X1為固定化前加入酶液的蛋白含量/mg；X2為洗液和上清液中蛋白含量/mg。

1.3.6 酶學性質分析

1.3.6.1 最適作用pH值和最適作用溫度

分別在不同pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）和不同溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）條件下，以1.3.5節的方法測定游離PLA1和固定化PLA1的相對酶活力。

1.3.6.2 貯藏穩定性

游離PLA1和固定化PLA1分別在25 ℃孵育20 d，每隔2 d定時測剩余酶活力。

1.3.6.3 操作穩定性

參考Yu Dianyu等[18]的研究，將固定化PLA1置于裝有菜籽毛油的三角燒瓶中，在50 ℃的水浴鍋中進行機械攪拌3 h，回收固定化PLA1，重復操作8 個批次。每次循環后，用pH 4.0的緩沖液沖洗固定化PLA1。計算每個循環后的殘余酶活力與初始酶活力（100%）百分比。

1.3.7 Fe3O4和Fe3O4@GPTMS磁性微球的表征

采用X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（attenuated total reflection Fourier-transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）、SEM和TEM對Fe3O4和Fe3O4@GPTMS磁性微球進行檢測和分析。樣品進行XRD測定，CuKα輻射；樣品進行ATR-FTIR測定，掃描范圍為500～4 000 cm－1；樣品進行SEM分析，加速電壓為15.0 kV，放大倍數為100 000 倍，噴金后在電鏡下觀察其表觀形貌；樣品進行TEM分析，加速電壓100 kV，放大倍數150 000 倍，噴金后在電鏡下觀察其形貌和粒徑分布。

2 結果與分析

2.1 固定化條件的優化

2.1.1 單因素試驗結果

2.1.1.1 最適緩沖液pH值的確定

圖1 pH值對酶固定化效果的影響Fig.1 Effect of pH on phospholipase immobilization

由圖1可知，相對酶活力及固定化率受緩沖液pH值的影響較大。在一定的固定化條件下，固定化率隨著pH值的升高而減小，而相對酶活力隨著pH值的升高先逐漸增大后逐漸減小。選擇pH 4.0，酶活力達到最大，固定化率為67.4%。這可能是由于pH值越遠離7.0，環氧基團與酶結合能力越強，固定化率越大[19]。但酶作為一種蛋白質，在過酸或者過堿的環境中，酶容易變性失活[20]。

2.1.1.2 最適酶液添加量的確定

圖2 酶液添加量對酶固定化效果的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on phospholipase immobilization

由圖2可知，固定化率隨著酶液的增加而逐漸減小，而相對酶活力隨著酶液的增加而逐漸增加，當酶液添加量達到載體所能固定的最大酶量時，相對酶活力趨于穩定，不再發生變化。這主要是由于隨著酶液的增加，載體上游離基團越來越少導致固定化率降低，而載體上結合的酶分子越來越多，酶活力增加，當酶在載體上的負載量達到最大值，相對酶活力也達到最大值，不再發生變化[21]。酶液添加量選3.0 mL，此時，酶活力最大，固定化率為67.4%。

2.1.1.3 最適固定化時間的確定

圖3 固定化時間對酶固定化效果的影響Fig.3 Effect of reaction time on phospholipase immobilization

如圖3所示，隨著固定化時間的延長，固定化率逐漸增大，在2 h趨于穩定，而相對酶活力先增加，在2 h后略微有所下降。這是由于載體的量是固定的，隨著固定化時間的延長，載體上的活性基團逐漸被酶結合，在2 h時載體結合酶量達到飽和，固定化率達到最大值，不再發生變化，而當固定化時間超過2 h后，酶蛋白失活導致相對酶活力略微降低[20]。因此，最適固定化時間為2 h，酶活力最大，固定化率為61.1%。

2.1.2 響應面優化固定化條件

2.1.2.1 響應面試驗結果

表2 響應面試驗設計與結果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數據進行多項式回歸擬合，結果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance of the regression equation

由表3可以看出，回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），校正系數R2為0.918 2，失擬項P值為0.637 8，回歸方程具有很高的擬合度和可信度，可用此模型對固定化條件進行分析和預測。校正決定系數為0.969 6，即此回歸方程可以解釋96.96%的酶活力數據的可變性。C、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），A和BC對響應面的影響比較顯著（P＜0.1），AB、AC對響應值無影響。各個試驗因素對酶活力的影響依次為：C（酶液添加量）＞A（緩沖液pH值）＞B（反應時間）。

獲得的回歸方程模型為：Y=3 528－58.75A－35B+301.25C－82.5BC－686.5A2－284B2－271.5C2。

根據回歸方程，確定PLA1固定化的最佳條件為緩沖液pH 3.98、反應時間1.85 h、酶液添加量3.58 mL/g，預測酶活力為3 618.14 U/g。

2.1.2.2 最優值的確定

為驗證所獲得結果的可靠性，進行3 次重復驗證實驗，對響應面的結果進行驗證，確定緩沖液pH 4.0、反應時間1.9 h、酶液添加量3.6 mL/g，此條件下進行固定化得到的酶活力為3 675 U/g，該值落在響應值Y的預測區內[3 437.23，3 799.00]內，說明該模型具有很好的擬合度。

2.2 酶學性質分析

2.2.1 最適作用pH值和最適作用溫度

圖4 pH值（A）和溫度（B）對游離酶和固定化酶活力影響Fig.4 Effects of pH (A) and temperature (B) on the activities of free and immobilized enzyme

分別考察在pH 4.5～7.0、溫度40～65℃范圍內，pH值和溫度對游離PLA1和固定化PLA1活力的影響。如圖4A所示，游離PLA1的最適作用pH值為5.0，固定化PLA1的最適作用pH值為6.0，固定化后，最適作用pH值向堿性方向偏移了1.0。此外，固定化PLA1比游離PLA1具有更寬的作用范圍。可能是由于酶分子與載體材料的性質不同，固定化酶復合物通過增強pH值耐受性避免構象變化[21]。

如圖4B所示，游離PLA1和固定化PLA1的最適作用溫度分別為50、55 ℃，固定化后，最適作用溫度提高了5 ℃。在較高的溫度范圍內，固定化PLA1比游離PLA1具有更高的相對活性。這可能是由于酶被固定在載體上限制了酶分子在高溫下的構象遷移，從而有效地阻止了酶的失活[22-23]。

2.2.2 貯藏穩定性

圖5 游離酶和固定化酶的貯藏穩定性Fig.5 Storage stability of free and immobilized enzyme

如圖5所示，在室溫下放置8 d，游離PLA1剩余酶活力為58.9%，而固定化PLA1剩余酶活力仍為80%以上；在室溫放置20 d后，游離PLA1活力損失90%左右，而固定化PLA1為初始酶活力的50%以上。這可能是由于固定化后酶的空間三維結構發生變化，分子間的氫鍵和靜電相互作用增強，酶分子的催化活性中心構象得以完整保存[24-25]。因此，固定化后，酶具備更長的貯藏周期，這將延長酶的使用壽命，拓寬酶的應用前景。

2.2.3 操作穩定性

固定化酶能多次重復使用，提高酶的可重復使用性是降低酶單次使用成本的重要途徑之一[10]。如圖6所示，相同的酶活力測定條件下，在重復菜籽油脫膠8 個批次后，仍保留81.1%的酶活力，固定化PLA1具有優良的操作穩定性。這主要是由于酶與載體上的環氧基共價連接，穩定性較強，使每次循環過程中較少的酶脫落[26]。

圖6 固定化酶的重復使用性Fig.6 Reusability of immobilized enzyme

2.3 Fe3O4和Fe3O4@GPTMS磁性微球的表征

2.3.1 XRD分析

圖7 XRD圖Fig.7 XRD pattern

如圖7所示，Fe3O4磁性微球的6 個特征峰（2θ為30.18°、35.48°、43.32°、53.68°、57.26°和62.84°）在Fe3O4@GPTMS磁性微球中也可以觀察到，且各峰的位置和相對強度與標準Fe3O4的XRD圖譜有很好的對應關系，表明制備的Fe3O4磁性微球為反式尖晶石結構，且經過環氧基修飾后，結構保持不變[27]。

2.3.2 ATR-FTIR分析

圖8 Fe3O4和Fe3O4@GPTMS磁性微球的衰減全反射傅里葉紅外吸收光譜圖Fig.8 ATR-FTIR spectra of Fe3O4 and Fe3O4@GPTMS magnetic microspheres

如圖8所示，Fe3O4磁性微球的ATR-FTIR圖譜在567 cm－1附近出現吸收峰，表明Fe—O發生伸縮振動，在3 360 cm－1附近出現吸收峰表明O—H鍵發生伸縮振動，這說明已經成功地合成了Fe3O4磁性微球。與Fe3O4磁性微球的ATR-FTIR圖譜對比發現，Fe3O4@GPTMS磁性微球的圖譜在1 040 cm－1附近出現Si—O鍵的吸收峰，且分別在2 970 cm－1和2 870 cm－1處多了一個吸收峰，這分別與—CH3和—CH2鍵的拉伸有關，表明Fe3O4磁性微球表面成功接合環氧基團[28]。

2.3.3 SEM和TEM分析

由圖9a、b可知，Fe3O4磁性微球和Fe3O4@GPTMS磁性微球顆粒大小均勻，近似球形，有團聚現象，這可能是由于粒子間的磁偶極相互作用[29]。由圖9c、d可知，Fe3O4磁性微球和Fe3O4@GPTMS磁性微球粒徑在10～30 nm之間，成功制備出納米尺寸的磁性微球。與Fe3O4相比，Fe3O4@GPTMS的形貌和尺寸分布幾乎沒有改變，這表明環氧基修飾沒有顯著改變Fe3O4磁性微球的形貌和尺寸分布[21]。且可以通過SEM和XRD圖得出修飾后的Fe3O4磁性微球仍保留Fe3O4磁性微球的結構特征[30]。

圖 9 SEM和TEM圖Fig.9 SEM and TEM images

3 結 論

以自制的環氧基修飾的Fe3O4磁性微球對PLA1進行固定化，XRD、ATR-FTIR、SEM和TEM分析表明成功制備出納米尺寸的載體，且環氧基被修飾在其表面。通過響應面試驗優化得到固定化PLA1的最佳條件為：1 g環氧基修飾的Fe3O4磁性微球和3.6 mL酶液在pH 4.0的緩沖液中，室溫條件下振蕩固定1.9 h。在此條件下，得到的酶活力為3 675 U/g，固定化率為61.1%。與游離PLA1相比，固定化PLA1的最適作用pH值從5.0移動到6.0，向堿性方向偏移1.0；最適作用溫度從50 ℃提高到55 ℃，提高了5 ℃，且pH值和溫度的作用范圍更廣，耐堿性和耐熱性更好。固定化PLA1的貯藏穩定性也得到很大程度的提高。將固定化PLA1用于菜籽油脫膠實驗，重復使用8 個批次后，仍保留81.1%的酶活力，表現出優異的可重復使用性。

利用磁場，本實驗制備的固定化PLA1極易從反應體系分離與回收，且穩定性好，操作簡單，適用于工業化生產。研究結果表明，環氧基修飾的磁性微球固定化酶是一種有效的生物催化劑，極具應用潛力。