鼠疫免疫學檢測技術的應用和研究進展

王蒴 王信惠 黎唯

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）引起的一種自然疫源性疾病，嚙齒動物為主要宿主和傳染源，蚤類是主要傳播媒介。在發生人間鼠疫時，鼠疫患者可間接轉變為傳染源，尤以肺鼠疫患者傳染性最強，通過飛沫可造成大范圍人間鼠疫的流行。鼠疫病程短、傳染性強、傳播速度快、致死率高，在我國被列為甲類傳染病。

鼠疫“四步檢驗”方法在鼠疫檢菌中發揮著重要作用，分離出鼠疫菌是判定鼠疫疫情、新鼠疫疫源地和臨床診斷鼠疫病例的重要依據，但該法耗時費力，分離到鼠疫菌至少需要3 d 時間，腐敗標本、時間過久標本或鼠疫患者服用抗生素等情況下，均影響鼠疫菌的檢出，尤其在人間鼠疫疫情處理過程中尋找潛在鼠疫患者顯然時間過長，從而易造成鼠疫疫情的擴散和蔓延，錯過最佳治療時間。因此，尋找快速、簡便、特異的免疫學檢測技術用于鼠疫疫情控制十分必要。間接血凝試驗（IHA）最早應用于鼠疫領域，在鼠疫防控和科學研究中發揮了重要作用，隨著新材料和檢測技術的進步，陸續出現了酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、放射免疫沉淀試驗（RIPA）、鼠疫F1McAb 酶免疫染色技術（EIT）、膠體金免疫層析技術（GICA）等免疫學檢測新技術，并逐步應用于鼠疫監測和人間鼠疫疫情處置工作中，現就鼠疫免疫學檢測技術的應用和研究進展做一綜述。

1 免疫學檢測技術

免疫學檢測技術的原理是通過抗原和抗體特異性反應結合實現的，F1 抗原是鼠疫菌特有的莢膜抗原，是菌體表面主要的免疫活性物質，能夠刺激感染性機體產生抗體并引起主要的抗體反應。抗原與相應抗體在體外一定條件下發生特異性結合，形成抗原-抗體復合物，鼠疫免疫學檢測技術通常用已知的F1抗原/抗體檢測未知的F1 抗體/抗原。

2 間接血凝試驗

IHA 是世界衛生組織（WHO）推薦的鼠疫血清學常規診斷方法，是目前我國應用最廣泛的鼠疫免疫學檢測方法之一。IHA 原理是將已知的鼠疫F1 抗原/抗體吸附于致敏的綿羊紅細胞上，攜帶F1 抗原/抗體的紅細胞在一定反應條件下與標本中相應的抗體/抗原產生特異性結合，通過沉淀呈現凝集相用以觀測實驗結果。IHA 包括：正相間接血凝試驗（IHA），用于檢測血清中的鼠疫F1抗體；反相間接血凝試驗（RIHA），用于檢測動物臟器或骨髓等標本中的鼠疫F1 抗原；該檢測方法在既往的鼠疫防控工作中發揮了十分重要的作用。IHA 通過初篩試驗和復判試驗兩步完成，初篩試驗用于選擇出陽性標本，復判試驗則為了排除假陽性。IHA 有2 種方法，分別為試管法和微量法，2 種方法的陽性率差異無統計學意義。Meyer 研究發現，IHA 檢出陽性率高于細菌學，但IHA檢出陽性率低于ELISA 和GICA等方法，王成祥等分別用IHA、ELISA 檢測3260 份動物血清樣本，用RIHA、ELISA、GICA 檢測322份自斃動物材料，結果顯示，IHA陽性檢出率低于ELISA，RIHA 陽性檢出率低于ELISA 和GICA。

IHA 主要用于鼠疫自然疫源地調查、疫源地監測、疑似鼠疫患者的診斷和追溯診斷。根據血凝陽性率和滴度可以預測該地區動物間鼠疫流行強度及趨勢。在未分離到鼠疫菌的情況下，IHA 具有重要的診斷意義。IHA 具有敏感性高、特異性強、快速、易操作等優點，但存在操作繁瑣、結果穩定性差；溫度、酸堿度、嗜異性凝集素等造成非特異凝集等不足。RIHA 主要用于新鮮（腐敗）臟器標本、干枯動物骨骼標本中鼠疫F1 抗原的檢測，甚至在腐敗1年后的材料中仍可獲得陽性結果，對判定當地鼠疫流行和追溯疫源有一定意義。RIHA 方法具有特異、快速的特點。但用該方法判定結果最短需2 h，還需有一定的技術要求，容易出現非特異性凝集。

3 酶聯免疫吸附試驗

ELISA 是一種靈敏、特異、快速、簡便的檢測方法，20 世紀70年代后在醫學領域得到廣泛應用。ELISA 檢測原理是將鼠疫F1 抗原/抗體包被于酶標反應板上，通過抗原/抗體反應將標本中的鼠疫F1 抗體/抗原結合在反應板上，經酶標記的抗原/抗體進行再次結合，通過酶催化底物產生顏色酶標儀機讀或肉眼觀測達到檢測目的。1979年Cavanaugh 等首次將ELISA 應用于人和嚙齒動物的鼠疫診斷中。在人類鼠疫診斷中，將酶標記在抗IgG 抗體上，若有抗F1 的IgG 結合在酶標板上，則這種標記抗體就結合上去顯示陽性反應；而在動物鼠疫監測中，是將酶標記在提純的F1 抗原上，這樣就使ELISA 成為適用于不同動物但僅可檢測鼠疫的方法。國內外很多學者對ELISA 進行改良，使其應用范圍更廣。Splettstoesser 等用F1 抗原ELISA 捕獲法檢測鼠疫患者血液、尿液和淋巴腺液中的F1 抗原，結果顯示，ELISA 法的敏感性和特異性均高于RIHA，該法最低檢測濃度可達到4 ng/mL。熱娜·吐爾地等用夾心法ELISA 檢測動物血清鼠疫F1抗體，同時用IHA 法進行比對，ELISA 檢測長尾黃鼠（Spermophilus undulatus）、 犬（Canis lupus familiaris）血清鼠疫F1 抗體的陽性率和平均滴度均高于IHA，差異非常顯著。王信惠等建立ELISA 捕獲法檢測犬和貓（Felinae）鼠疫抗體IgM 方法，并觀測犬和貓感染鼠疫菌后鼠疫抗體IgM 的消長動態，犬和貓鼠疫抗體IgM 高峰期分別為5～23 和7～10 d，犬和貓鼠疫抗體IgM 分別在第46 天和第30 天后降至陽性標準以下，通過檢測犬和貓鼠疫抗體IgM 對及時掌握北方旱獺（Marmota bobak）和南方家鼠鼠疫自然疫源地動物間鼠疫近期流行狀態有積極意義。目前在我國鼠疫監測中，已廣泛使用ELISA（夾心法）檢測各種不同血清中的鼠疫F1 抗體和臟器或骨髓中的F1 抗原。常婭莉等研制的鼠疫菌ELISA 診斷試劑盒經杜春紅等應用效果評價，其特異性、穩定性和敏感性均高于IHA 和RIHA，現已批量生產，在鼠疫防治和科研工作中具有廣泛的應用前景。

4 放射免疫沉淀試驗

RIPA 于20 世紀70年代引入到鼠疫F1 抗體的檢測中，20 世紀80年代初我國學者建立的RIPA應用于全國大部分地區的鼠疫監測工作中，并證實RIPA 是一種敏感性高、特異性強的檢測方法。RIPA 是用放射性核素標記鼠疫特異性抗原，當被檢血清中含有鼠疫特異性抗體時，抗原抗體反應形成抗原抗體復合物，根據抗原抗體復合物的放射性含量，即可檢測出血清中特異性抗體的含量。

RIPA 具有特異性高、敏感性強、檢出率高等優點。楊智明等用RIPA對云南省2956份人血清進行鼠疫F1抗體檢測，結果顯示，RIPA 的陽性檢出率和陽性抗體幾何平均滴度均高于IHA，且IHA 陽性者RIPA 無一陰性。趙志海和王邁用標記的鼠疫菌F1 抗原（125I-F1）與抗假結核菌等10 種菌的21 份血清進行交叉實驗，均未出現交叉反應。用IHA 檢測感染鼠疫56 個月的黃鼠血清呈陰性，12 個月后用RIPA 法仍能檢測到抗體，說明RIPA能檢出不完全抗體，從而提高了檢出率。此外，RIPA 適用于靜息期內的疫源探索，對發現新鼠疫疫源地，鑒定疫源地的活動狀態也具有重要意義。云南省野鼠鼠疫疫源地于1974年被發現，自1985年有學者用RIPA 對該省疫源地的動物血清進行流行病學調查，結果除在疫源地的5 個縣檢出陽性血清外，還在其外圍的2 個縣檢出了陽性血清，不僅驗證了疫源地的分布，還發現了新的疫源地。雖然RIPA具有較高的敏感性和特異性，但同時具有放射性同位素，對操作者存在潛在危害，現已幾乎不再使用。

5 膠體金免疫層析技術

GICA 是一種特異、敏感、快速、易操作的檢測方法。該方法興起于20 世紀80年代，是一種新的免疫學檢測方法，在生物、醫學等領域得到了廣泛應用。Chanteau 等最先將GICA 引入到鼠疫早期診斷和檢測應用中。鼠疫F1 抗原GICA 法的原理是將鼠疫F1 單克隆抗體、鼠疫F1抗原分別固定于硝酸纖維素膜作為檢測帶和質控帶，膠體金標記鼠疫F1 單克隆抗體固相后放置于加樣孔和檢測帶之間，應用膜層析雙抗原夾心法檢測樣本中的鼠疫F1 抗原。該方法按照金顆粒標記對象不同（F1 抗原或F1 抗體），可以檢測不同對象（F1 抗體或F1 抗原）。近年來鼠疫抗原/抗體膠體金技術逐漸成熟，并廣泛應用于鼠疫的快速診斷和監測中。王鵬等建立的檢測鼠疫F1 抗原/抗體膠體金試紙條，可在15 min 內檢出粗制F1 抗原濃度為0.5 ng/mL，最小檢出EV 菌菌量為10 萬菌體/mL，特異性達到100%，與44 株鼠疫近緣菌無交叉反應。2006年為評價該膠體金試紙條在現場應用中的效果，采用GICA、IHA及ELISA 分別對新疆維吾爾自治區（新疆）1304 份和內蒙古自治區（內蒙古）100 份血清進行檢測，新疆血清檢測中，GICA、IHA 和ELISA3種方法符合率高度一致，GICA 敏感度高于IHA 及ELISA；內蒙古血清檢測中，GICA 與IHA 的檢測結果完全一致。采用RGICA、RIHA 和F1- ELISA 分別對新疆224 份和內蒙古100 份鼠類臟器標本進行檢測，新疆鼠類臟器檢測結果顯示，RGICA、RIHA 和F1-ELISA3 種方法和檢菌結果符合率高度一致，RGICA 的敏感性高于RIHA 及F1-ELISA；對內蒙古鼠類臟器檢測中，RGICA 和RIHA 與檢菌結果完全一致，且RGICA 比RIHA 的敏感性高13%。證實該膠體金免疫層析試紙條具有較好的敏感性與特異性。

GICA 法實驗結果肉眼可測，不需要任何儀器，尤其適合野外和突發疫情的情況下使用。但GICA 法易造成漏檢，試劑的靈敏度也會限制GICA 法的靈敏度，膠體金試劑的 靈敏度為10 ng/mL，當檢測量低于10 ng/mL 時，即容易出現假陰性。該法只能用于初篩檢測，不能作為確診依據，需與IHA 或ELISA 法結合應用，結果更為可靠。

6 鼠疫F1McAb 酶免疫染色技術

EIT 也稱酶免疫組織化學技術，是指在一定條件下，應用酶標抗體（抗原）與組織或者細胞標本中的抗原（抗體）發生反應，形成帶酶分子的復合物，酶催化底物產生有色的不溶性產物，使組織或細胞被染色，通過顯微鏡可識別標本中抗原（抗體）的分布位置和性質，也可通過圖像分析技術達到定量的 目的。隨著鼠疫F1 單克隆抗體的出現，相關學者將鼠疫F1McAb 與酶免疫染色技術相結合，建立了鼠疫F1McAb 酶免疫染色法：將待檢標本進行固定后，加入辣根過氧化物酶標記的鼠疫F1 單克隆抗體，最后加底物進行顯色。鼠疫F1 單克隆抗體的特異性和酶免疫染色鼠疫菌的敏感性相結合技術，提高了檢測的準確性，在檢測實驗室感染鼠疫菌小鼠臟器標本F1 抗原中得到很好的應用，HRP-F1McAb 酶免疫染色技術檢測陽性率為98%，與細菌學、RIHA和ELISA3 種方法陽性檢出率差異無統計學意義，具有較好的敏感性和特異性。白雪薇等用EIT 法對細菌標本進行鼠疫菌檢測，細菌標本酶免疫染色法檢測結果與實際相符，酶免疫染色技術檢測鼠疫菌的靈敏性為1000 ng/mL。EIT 法對儀器要求不高，顯色后在普通顯微鏡下可觀察結果，1 h 完成實驗，且標本可長期保存，是一種簡便、特異、省時的檢測方法，適用于鼠疫早期快速診斷與疫情監測工作。

7 結語

IHA 在我國應用可追溯到70年代，至今已40 余年，曾在鼠疫研究和鼠疫追溯診斷方面發揮著重要作用，至今仍在應用。IHA 屬于液相反應，溶液pH 值、溫度、離子強度以及標本腐敗程度均影響反應結果，滴度高的標本存在前滯反應易漏診，且不同批次的試劑存在一定差異，穩定性難以保證。RIPA 雖然敏感，但陽性標本和假陽性標本的敏感性均提高，特異性也難保證且對人體存在放射性危害，現已基本不太使用。ELISA 屬于固相反應，受標本腐敗程度影響較小，在酶標板洗滌過程中可將未結合的抗 原或抗體以及標本雜質洗滌清除，從而保證了結果的特異性和穩定性。EIT 是目前鏡檢鑒定鼠疫菌最快的方法，常溫1 h 出結果，鼠疫F1McAb 保證了結果的特異性，該法快速、特異、簡便，適用于鼠疫疫情的處理。

鼠疫免疫學檢測方法的敏感性、特異性和穩定性取決于鼠疫F1抗原和抗體純度，目前鼠疫免疫學檢測中所用的F1 抗原仍是粗提的，純度較低。重組F1 抗原易提取、純度高且具有良好的免疫活性，用重組F1 抗原代替天然F1 抗原已十分必要。鼠疫F1McAb 的推廣和應用保證了免疫學檢測技術的敏感性和特異性。近年來，GICA 在鼠疫野外監測及快速診斷中得到較好地推廣應用，GICA 操作簡單，無需儀器，具有較高特異性和敏感性，15～30 min即可判定結果，但該法只能定性不能定量，需與ELISA 或IHA 等其他方法聯合應用。每一種鼠疫免疫學檢測方法都有其優缺點，在條件允許的情況下，應多種方法同時應用，可以有效解決非特異性、假陽性等問題，達到有效、快速、準確地判定鼠疫疫情的目的，從而阻止鼠疫疫情的進一步傳播和擴散。■