金匱腎氣總苷中馬錢苷吸收及代謝動力學過程＊

孫向明，宋 輝，胡 揚，丁晶鑫，李文蘭＊＊

（1.哈爾濱商業大學藥學院 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心 哈爾濱 150076）

金匱腎氣丸是張仲景《金匱要略》中的經典名方[1]，該處方由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮、肉桂、附子（制）八藥味組成，具有溫補腎陽，化氣行水之功效。時至今日仍被廣泛運用于腎虛水腫，腰膝酸軟，小便不利，畏寒肢冷。臨床上用于治療多種疾病，尤其是治療腎陽虛以及由男性更年期綜合征引發的一些病癥[2-6]。前期實驗表明，金匱腎氣總苷類成分能顯著增加腎陽虛型大鼠血清睪酮含量，提高SOD活性，降低MDA水平，是提高雄性大鼠性激素及抗衰老的主要有效部位[7]。

口服給藥是中藥方劑最主要的用藥方式，決定藥用價值的首要環節就是藥物吸收的程度和速度。對復方潛在效應物質中主要成分進行代謝動力學研究，可有效評價潛在效應物質在體內的吸收、分布、代謝、排泄過程，具有整體、綜合、動態和定量的特點，為設計和優化給藥方案、保證臨床用藥的安全性和有效性和指導中藥新藥的開發設計等方面都具有重要意義。馬錢苷是金匱腎氣丸組方中山茱萸的有效成分，具有明顯的抗炎、調節免疫、抗休克、強心等作用[8-10]，在金匱腎氣總苷中的量約占7.25%[11]。鑒于馬錢苷具有較強藥理活性和藥用價值，是總苷中含量較高的成分，且性質比較穩定，以原型成分入血發揮作用[12]，本文將以馬錢苷作為金匱腎氣丸總苷有效部位的代表成分進行腸吸收機制、影響因素以及藥代動力學的研究。旨在揭示金匱腎氣總苷藥效物質的體內作用過程，以期提高總苷的生物利用度，為申報新藥、進行臨床研究提供科學依據。

1 材料

1.1 試藥與儀器

所用藥材熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓、附子（制）、肉桂均購于寶豐醫藥商業有限公司，并經哈爾濱商業大學張德連教授鑒定；馬錢苷標準品購自中國藥品生物制品檢定所（含量＞98%，批號：111640-200502）（圖1）；酚紅購自上海研一生物科技有限公司（批號：20050602）；甲醇、乙腈、冰醋酸為色譜純，其他試劑為分析純，水為雙蒸水；Waters高效液相色譜儀（W2695泵、W2996DAD檢測器）；751型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；DZK-2電熱恒溫振蕩水槽（上海邁捷實驗設備有限公司）；TDL80-2B高速離心機（上海宇工機械有限公司）；HL-2型恒流泵（上海嘉鵬科技有限公司）；Sartorius普及型pH酸度計PB-10（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；AR1140型電子天平（美國奧好斯科技有限公司）。

1.2 實驗動物

雄性Wistar大鼠（220±20）g購自長春國家生物產業基地實驗動物中心，合格證號：SCXK-（吉）2003-0004。實驗前禁食12 h，自由飲水。

2 方法

2.1 總苷中馬錢苷的在體腸吸收研究

2.1.1 總苷的制備

金匱腎氣總苷由實驗室制得：按處方比例精密稱取藥材，加入14倍量體積分數為58%的乙醇，回流提取3次，每次180 min，減壓回收乙醇，采用紫外-可見分光光度計法進行總苷含量測定[11]，以馬錢苷計乙醇提取物中總苷的含量為3.42%，加適量蒸餾水稀釋成生藥質量濃度為0.25 g·mL-1的藥液，以稀鹽酸調pH=6，上D-101型大孔吸附樹脂柱充分吸附后，用30 BV、pH=8的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，干燥得總苷，總苷（以馬錢苷計）占總洗脫物的43.87%。

2.1.2 溶液的制備

緩沖液：精密稱取 NaCl6.87 g，KCl0.4 g，NaHCO32.2 g，NaH2PO40.13 g，MgSO40.122 g，CaCl20.25 g，葡萄糖5 g置1 000 mL容量瓶中，加適量蒸餾水超聲溶解，補足蒸餾水定容至刻度，作為循環液備用。

酚紅系列標準溶液：精密稱取酚紅適量，緩沖液稀釋成質量濃度為100 mg·L-1的儲備液備用，分別精密吸取酚紅儲備液適量，用緩沖液稀釋成質量濃度為10、20、30、40、50 mg·L-1的酚紅系列標準溶液，置冰箱4℃冷藏，備用。

圖1 馬錢苷結構式

圖2 馬錢苷及酚紅溶液的紫外吸收光譜圖（1-馬錢苷2-酚紅）

總苷供試品溶液：稱取不同量的總苷浸膏，將其溶于20 mg·L-1的酚紅溶液中，以3 000 r·min-1轉速離心5 min，取上清液，制得低（含總苷0.17 mg·mL-1）、中（含總苷0.51 mg·mL-1）、高（含總苷1.87 mg·mL-1）3種質量濃度的總苷供試品溶液。

2.1.3 酚紅檢測波長的選擇及標準曲線繪制

用緩沖液將酚紅和馬錢苷標準品配成適當濃度，掃描其紫外吸收光譜圖，掃描波長范圍為200-600 nm。酚紅的最大吸收波長在558 nm處，馬錢苷在此處幾乎沒有吸收（圖2）。因此，確定酚紅的檢測波長為558 nm。精密吸取酚紅系列標準溶液各0.5 mL，分別加入NaOH溶液（摩爾濃度為0.20 mol·L-1）5.0 mL，搖勻，在酚紅的最佳檢測波長處測定吸光度，以酚紅質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到酚紅的線性回歸線方程為 Y=0.018X+0.042 9，R=0.999 9，（n=5）。表明酚紅在10-50 mg·L-1內線性關系良好。

2.1.4 色譜條件

色譜 柱：Symmetry C18柱（3.9 mm × 150 mm，5 μm）；流動相：0.1%冰醋酸水溶液-甲醇（80∶20）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL·min-1。檢測波長為237 nm。

2.1.5 馬錢苷標準曲線繪制

圖3 馬錢苷標準品（A）、總苷供試品（B）及空白循環液（C）的液相色譜圖

精密稱取馬錢苷標準品2.0 mg置10 mL容量瓶中，用緩沖液稀釋定容，作為馬錢苷儲備液。再取適量儲備液，分別稀釋成質量濃度為0.10、0.08、0.04，0.02、0.01 mg·mL-1的標準品溶液。用0.45 μm微孔濾膜過濾后，在2.1.4項下的色譜條件下進樣10 μL，記錄馬錢苷的峰面積，以峰面積對質量濃度進行線性回歸，得到線性方程為：Y=2×106X-41 688,R=0.999 8，（n=3）。表明馬錢苷在0.01-0.10 mg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.1.6 方法學考察

馬錢苷的專屬性實驗：在2.1.3項下的色譜條件下，馬錢苷的保留時間為10.66 min，空白循環液在該位置無干擾峰（圖3），總苷的色譜圖中在同一保留時間可見馬錢苷的峰，且與其他組分達到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數按馬錢苷峰計不低于5 000。

精密度實驗：精密吸取質量濃度為0.04 mg·mL-1的馬錢苷標準品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液10 μL，連續進樣5次，計算峰面積的RSD值為0.17%，小于2%，精密度良好。

穩定性實驗：取質量濃度為0.20 mg·mL-1的馬錢苷標準品溶液，分別于0、6、12、18、24、30 h取樣，計算峰面積的RSD值為0.74%，小于2%，表明30 h內馬錢苷穩定性良好。

回收率實驗：取已知含量的樣品溶液3份，分別加入不同體積質量濃度為0.04 mg·mL-1的馬錢苷標準品溶液，使加入馬錢苷的量達到樣品中馬錢苷含量的80%、100%、120%，測定樣品中馬錢苷的量，馬錢苷平均回收率為99.62%，RSD值為1.09%，小于2%，表明該方法的準確度良好，滿足測定要求。

2.1.7 大鼠在體腸吸收實驗[13,14]

將實驗動物分為11組：總苷低、中、高劑量組（含馬錢苷質量濃度分別為 0.01 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.11 mg·mL-1）；循環液pH值6、7、8組（含馬錢苷質量濃度均為0.01 mg·mL-1）；十二指腸、空腸、回腸組（含馬錢苷質量濃度為0.01 mg·mL-1）；P-gp誘導劑利福平組和P-gp抑制劑維拉帕米組（含馬錢苷質量濃度為0.01 mg·mL-1，含利福平或維拉帕米質量濃度為0.10 mg·mL-1）。將大鼠禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.003 mL·g-1），固定，置加熱器上隨時調溫以保持體溫。沿腹腔中線打開腹腔，結扎膽總管，并分離出所需腸段，于切口處插管（出液口插管約3 cm），結扎。首先用適量的生理鹽水將小腸內容物沖洗干凈，然后用預熱至37℃的循環液以5 mL·min-1的速度恒定流速平衡10 min，再以空氣排凈，將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕，于紅外燈下保持大鼠體溫。各組循環液30 mL保持（37±5）℃恒溫，以5 mL·min-1循環10 min后，記為0時，后循環液以1 mL·min-1的流速循環160 min。分別于 20、40、60、80、100、120，140、160 min時取循環液2 mL，用微孔濾膜過濾后，取濾液1 mL進樣，測定各時間點循環液中馬錢苷的量。同時，取0.5 mL濾液測定酚紅的量，同時補加2 mL酚紅溶液。最后將大鼠處死，剪下被灌流腸段，測量腸內徑及長度。采用上述實驗方法分別考察馬錢苷濃度、pH值、腸段及P-gp各因素對總苷中馬錢苷在體腸吸收的影響規律。以馬錢苷剩余藥量的對數值對取樣時間作線性回歸，由斜率求得吸收速率常數Ka，由剩余藥量可以求得藥物吸收量。采用SPSS18.0軟件對各組數據進行統計處理，并進行單因素方差分析。

2.2 總苷中馬錢苷的藥代動力學研究

2.2.1 灌胃藥液的制備

取總苷浸膏適量，用蒸餾水制成低、中、高濃度的總苷灌胃液，濃度分別為：0.17 g·mL-1（馬錢苷濃度10 mg·mL-1），0.26 g·mL-1（馬錢苷濃度15 mg·mL-1），0.35 g·mL-1（馬錢苷濃度20 mg·mL-1）。取高濃度的總苷灌胃液，加入適量維拉帕米，使其終濃度為1 mg·mL-1，作為維拉帕米+總苷組的灌胃藥液。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18(150 mm×3.90 mm，5 μm)，柱溫：30℃，流速1 mL·min-1，檢測波長為237 nm。流動相條件：乙腈：1%醋酸水（8∶92）。

2.2.3 標準曲線的繪制

精密稱取馬錢苷對照品0.84 mg，以甲醇溶解并定容至50 mL，配制成16 800 ng·mL-1的標準儲備液，分別精密吸取馬錢苷標準儲備液 50、200、500、750、2 500、4 750、6 250 μL，以甲醇梯度稀釋并定容至10 mL，制備成質量濃度為84、336、840、1 260、4 200、7 980、10 500 ng·mL-1的系列溶液，精密吸取系列溶液200 μL，加至離心管中，揮干，加入大鼠空白血漿200 μL，混勻振蕩1 min，加入100 μL 6%高氯酸沉淀蛋白，于混勻振蕩器上振蕩1 min，以14 000 r·min-1轉速離心15 min，在2.2.2項下的色譜條件下取上清液50 μL進樣分析。以測定的峰面積（Y）為縱坐標，馬錢苷濃度（X，ng·mL-1）為橫坐標進行線性回歸。馬錢苷血藥濃度標準曲線的回歸方程為Y=63.979X-4 661.2，R=0.999 7，線性范圍84～10 500 ng·mL-1。在此色譜條件下，測得馬錢苷的最低檢測濃度為78 ng·mL-1。

2.2.4 方法學考察

專屬性實驗：取空白血漿、給藥后的血漿以及加入適量馬錢苷的血漿各200 μL，按2.2.3項下“振蕩1 min”之后的步驟處理并進樣分析，色譜（圖4）（1號峰馬錢苷的保留時間為9.58 min），經比較可知血漿中的內源性雜質與總苷內的其他成分對馬錢苷的測定沒有干擾。說明本法具有較高的專屬性。

精密度、穩定性及回收率實驗：在一日或日間（3天）不同時間點，按標準曲線項下操作配制馬錢苷高（接近標準曲線上限）、中、低（接近最低檢測限）三個濃度的血漿溶液，每個濃度5份，按2.2.3項下“振蕩1 min”之后的步驟操作。測得馬錢苷的日內精密度RSD值為3.56%，日間精密度RSD值為4.58%（n=5），5 h內的穩定性RSD值為5.86%。總苷中馬錢苷的絕對回收率為88.93%，RSD值為2.75%；相對回收率為96.2%，RSD值為3.73%。上述數據結果表明樣品穩定性良好，實驗所采用的方法精密度、回收率均符合生物樣品的檢測要求。

圖4 馬錢苷標準品血漿（A）、總苷給藥后血漿（B）及空白血漿（C）的液相色譜圖

2.2.5 藥代動力學研究

Wistar大鼠禁食12 h，以各劑量組要求按10 mL·kg-1灌胃給藥，分別于給藥后10、20、30、45、60、90、120、180、240、360 min由眼眶靜脈叢取血0.5 mL，置肝素化的離心管內，輕輕轉動約1 min，以3 000 r·min-1轉速離心10 min，取上清液，于-20℃凍存。將凍存血漿取出置于4℃下緩慢解凍，取200 μL血漿，按2.2.3項下“振蕩1 min”之后的步驟處理并進樣分析。

3 結果與分析

3.1 總苷中馬錢苷在體腸吸收研究

3.1.1 濃度對總苷中馬錢苷吸收的影響

腸道的平均pH值為7.4，故在循環液pH值為7.4生理條件下，采用全腸段循環灌流法，考察藥物低（含馬錢苷0.01 mg·mL-1）、中（含馬錢苷0.03 mg·mL-1）、高（含馬錢苷0.11 mg·mL-1）3個質量濃度時總苷中馬錢苷的吸收規律。數據（表1）。

經線性回歸統計，馬錢苷的吸收量對質量濃度的回歸方程為：Y=652.32X-5.653 2（R=0.999 3），表明馬錢苷在0.01-0.11 mg·mL-1范圍內，各濃度的吸收量與藥物濃度呈良好線性關系。經方差分析，吸收速率常數無顯著性差異（P＞0.05），符合線性一級動力學過程，提示馬錢苷在該范圍內的吸收過程為被動擴散過程。

表1 金匱腎氣總苷中馬錢苷的吸收量及吸收速率（n=5）

表2 不同pH值下總苷中馬錢苷的吸收量及吸收速率（n=5）

表3 不同腸段總苷中馬錢苷的吸收量及吸收速率（n=5）

表4 利福平及維拉帕米對總苷中馬錢苷吸收量及吸收速率的影響（n=5）

圖5 灌胃3個劑量總苷后馬錢苷血藥濃度-時間曲線圖

3.1.2 pH值對總苷中馬錢苷吸收的影響

用稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液調節總苷樣品溶液（含馬錢苷質量濃度為0.01 mg·mL-1）的pH值分別為6、7、8，全腸段循環灌流，考察循環液的pH值對馬錢苷的吸收量及吸收速率影響的情況（表2）。

總苷中馬錢苷的吸收量及吸收速率在循環液的pH值為6-8范圍內無顯著性差異（P＞0.05）。表明馬錢苷的吸收不受環境酸堿度的影響，符合苷類成分的特征（表2）。

3.1.3 腸段對總苷中馬錢苷吸收的影響

結扎所需腸段：十二指腸段自幽門1 cm處開始，空腸段自幽門15 cm處開始，回腸段為盲腸上行20 cm處開始，各段均向下取約10 cm，取pH=7.4的總苷樣品溶液（含馬錢苷質量濃度為0.01 mg·mL-1），應用分腸段灌流法[15]考察總苷中馬錢苷在各個腸段的吸收情況（表3）。

結合表3分析可知：總苷中馬錢苷在十二指腸腸段的吸收明顯優于空腸及回腸腸段（P＜0.05），而后兩者無顯著性差異（P＞0.05）。

3.1.4 P-糖蛋白（P-gp）對總苷中馬錢苷吸收的影響

取pH=7.4的總苷樣品溶液（含馬錢苷質量濃度為0.01 mg·mL-1，含利福平或維拉帕米質量濃度為0.10 mg·mL-1）為循環液，考察總苷中馬錢苷在與P-gp誘導劑或抑制劑合用時與單獨用藥時吸收情況的差異（表4）。

利福平與維拉帕米分別作為P-gp的誘導劑與抑制劑，結合（表4）中數據分析可知：利福平組馬錢苷的吸收量及吸收速率較對照組有顯著降低（P＜0.01），維拉帕米組馬錢苷的吸收量及吸收速率較對照組有顯著升高（P＜0.01)），即與馬錢苷合用時分別呈現出對藥物吸收的抑制和促進作用。

3.2 總苷中馬錢苷的藥代動力學研究

大鼠灌胃給予3個劑量總苷及維拉帕米+總苷后，按2.2.5項下方法實驗，采用3P97程序進行數據處理，經模型擬合，確定馬錢苷最佳模型為一室開放模型，得到馬錢苷在大鼠血漿中的藥時曲線（圖5）所示，各組主要的代謝動力學參數（表5）。

根據表5的藥動學參數，總苷低劑量組馬錢苷Cmax為 3 556.9 ng·mL-1，藥時曲線下面積（AUC0-∞）為0.35 mg·min·mL-1，相比之下，中劑量組Cmax提高了1.48倍，AUC0-∞提高了2.06倍；高劑量組Cmax提高了2.04倍，AUC0-∞提高了2.15倍，表明各劑量組馬錢苷的藥動學行為成線性關系。經模型擬合，以AIC值最小原則結合相關指數、相關系數等指標確定總苷中馬錢苷的最佳模型為一室開放模型。經SPSS軟件驗證，各劑量組間主要動力學參數無顯著性差異，Ka為0.04 min-1，Ke為 0.01 min-1，T1/2Ke為 81 min，Tmax為 54 min。以低劑量組各藥動學參數分析可知：馬錢苷吸收入血較快，52 min即可達到最大血藥濃度Cmax3 556.9 ng·mL-1，以一室開放模型在體內分布，T1/2Ke為 85 min，CL/f（s）為0.34 L·min-1·kg-1，表明馬錢苷在大鼠體內消除較快。

表5 金匱腎氣總苷中馬錢苷的藥動學參數（n=5）

總苷高劑量組Ka為0.04 min-1，Ke為0.01min-1，Tmax為52 min，T1/2Ke為78 min，Cmax為7 271.4 ng·mL-1，而與維拉帕米合用后，Ka為0.08 min-1，Ke為0.01 min-1，Tmax為 35 min，T1/2Ke為 85 min，Cmax為 10 443.1 ng·mL-1，AUC0-∞增加了0.7倍，經SPSS軟件驗證，維拉帕米對總苷中馬錢苷的Tmax、Cmax、Ka、AUC0-∞等藥動學行為有顯著影響（P＜0.05）。尤其是吸收過程，可顯著增加馬錢苷的吸收速率和吸收量，提高了馬錢苷的吸收速度和生物利用度，從藥動學的角度驗證了馬錢苷在大鼠體內的吸收過程受到P-gp外排作用的影響。

4 討論

在腸吸收的過程中，不僅藥物會被吸收，水分也會被吸收，使循環液體積減少，致使無法通過測定藥物質量濃度來計算藥物的剩余量。而酚紅在小腸內幾乎不被吸收，可用于標定循環液的體積[16]。因此，本實驗中向循環液中加入已知量的酚紅，通過測定不同時間點的酚紅的質量濃度，推算循環液的實際體積，從而準確的計算剩余馬錢苷的量。

維拉帕米是P-gp的抑制劑，與金匱腎氣總苷合用后，能顯著升高總苷中馬錢苷的吸收量及吸收速率，呈現出對藥物吸收的促進作用。在藥動學研究中，合用維拉帕米后，Tmax、Cmax、Ka、AUC0-∞等參數均顯著增加，表明馬錢苷的吸收確實受P-gp的影響，提示在臨床用藥時可以與維拉帕米等抑制劑合用，以提高其生物利用度，增強藥物療效。在不同腸段吸收的研究中，總苷中馬錢苷在十二指腸腸段的吸收明顯優于空腸及回腸腸段，提示總苷中馬錢苷吸收也具有位置選擇性，可制成控釋制劑以提高其藥效。由于總苷為金匱腎氣丸的有效部位，且療效顯著，今后更易于應用于臨床，因此，可根據總苷中馬錢苷的吸收部位選擇性，通過控制其釋藥部位來提高總苷中馬錢苷的藥效。

山茱萸是金匱腎氣丸的組方藥味，通過查找相關文獻[17]，進一步與山茱萸提取物中馬錢苷的大鼠藥代動力學比較發現：金匱腎氣總苷中和單味藥山茱萸中的馬錢苷的藥代動力學模型均符合一室模型，山茱萸中馬錢苷的達峰時間為33.90 min，吸收半衰期為12.47 min，消除半衰期為52.45 min，而總苷中馬錢苷低劑量組的對應參數分別為52.28 min、19.55 min、84.79 min，相比之下均略高于前者，提示馬錢苷在復方有效部位中的吸收和消除過程變緩，在體內作用時間延長，推測可能由于受到復方中其他藥味及成分的影響，表明中藥復方最終藥效的發揮是各藥物各成分之間的一種綜合作用和效應。總體而言，馬錢苷在山茱萸和金匱腎氣總苷中的吸收和消除均較快。

依據藥代動力學和在體腸吸收機制研究，揭示了金匱腎氣總苷有效部位的ADME機制，充分證明BS總苷的吸收受到P-gp外排作用的影響。通過參考腸吸收動力學及藥物動力學參數，指導新藥的設計，正確地闡明藥物的劑型和生物因素與藥效的關系，以評價藥物制劑的質量，設計合理的劑型，保證臨床用藥的安全性和有效性，以期開發出生物利用度高的有效制劑。