糖腎方改善糖脂代謝紊亂“肝腎同治”機制研究＊

趙婷婷，張浩軍，嚴美花，李 平

（中日友好醫院臨床醫學研究所免疫炎性疾病北京市重點實驗室 北京 100029）

糖尿病已成為世界范圍內嚴重危害人類健康的流行性疾病，其發病人數日益增長，其中II型糖尿病占90%以上。我國18歲以上人群糖尿病患病率已達11.6%，患病人口1.14億，而糖尿病前期患者高達50.1%[1]。糖尿病并發癥如糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要死因，據國際糖尿病組織報道，2013年全球約509.7萬人因糖尿病及其并發癥而死亡，其中中國患者127.1萬人[2]。因此，糖尿病并發癥發病機制和藥物防治已成為當前醫學研究重點之一。

脂代謝紊亂是糖尿病及其并發癥發生發展的重要機制。多項前瞻性研究已證實脂代謝紊亂是預測2型糖尿病發生的獨立危險因素。糖尿病血脂異常的主要臨床表現為血清甘油三酯升高和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）降低，可伴低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoproteincholesterol，LDL-C）升高[3]。糖尿病患者不能有效地利用葡萄糖，導致脂肪動員增加，血循環中游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）升高。過剩的FFA進入脂肪細胞合成為甘油三酯被儲存起來，FFA在細胞內持續積聚導致脂毒性的產生。FFA在肝組織蓄積表現為非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD），在腎臟則導致DN。

糖尿病患者體內FFA水平升高激活炎癥通路，肝臟一方面成為炎癥因子作用的靶器官，同時也通過炎癥因子釋放加重了炎癥反應，促進了脂肪肝[4,5]和DN的病理進程[6]。NAFLD患者微量蛋白尿患病率顯著高于無脂肪肝患者，且獨立于一些潛在的混雜變量[7]，提示NAFLD和DN有著密切聯系。因此，糾正與改善脂代謝紊亂在糖尿病肝腎損害的防治中具有重要意義。

本團隊在國家科技部“973”計劃課題、國家自然科學基金委員會國際合作重點項目等支持下，對近三十年來中醫藥治療糖尿病腎病1646篇文獻進行了系統的梳理，繼承前人經驗，結合自身臨床實踐，創新性提出“從肝論治”糖尿病腎病，以“益氣柔肝、活血通絡”立法，組方糖腎方。下文將從糖腎方治療糖尿病腎病臨床研究和體內外基礎實驗研究和化學成分研究等方面進行描述。

1 糖腎方治療DN改善脂代謝的臨床試驗研究

2007年4 月至2009年12月間，團隊在北京、上海、河北唐山等地6家三甲醫院開展了多中心、隨機雙盲、安慰劑平行對照臨床試驗（注冊號：ChiCTR-TRC-10000843，中日友好醫院倫理號：2006-059）。共納入180例氣虛血瘀證2型糖尿病腎病（符合微量白蛋白尿期和顯性蛋白尿期）患者，在ACEI或ARB基礎治療上，受試者按2:1的比例隨機分為糖腎方組或安慰劑組。其中糖尿病微量白蛋白尿患者98例（糖腎方組66 vs安慰劑組32），大量白蛋白尿患者82例（糖腎方組56 vs安慰劑組26），給藥治療24周。

研究結果[8]顯示：糖腎方改善了顯性蛋白尿期患者倦怠乏力、肢體麻木等氣虛血瘀相關癥狀，與安慰劑比較差異顯著（P=0.0371）。在微量白蛋白尿期，糖腎方治療組在減少尿蛋白排泄和改善腎小球濾過率方面與國際公認的一線用藥ACEI/ARB療效一致，在延緩腎功能進展方面更具優勢；在顯性蛋白尿期，尿蛋白排泄增加，腎小球濾過率呈進行性下降，此時ACEI/ARB加安慰劑治療無法阻止疾病進展，在此階段糖腎方明顯起到了降低24 h尿蛋白定量，提高腎小球濾過率的治療作用。同時發現，糖腎方顯著降低DN患者總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride）、LDL水平，升高HDL水平，改善脂代謝紊亂[9,10]。兩組不良事件發生率比較差異無統計學意義。幾年來，我們在全國多家三級甲等醫院推廣使用糖腎方治療DN（氣陰兩虛夾瘀型），收到良好的效果。

2 糖腎方減輕糖尿病肝腎組織損害的作用研究

本團隊先后利用4種糖尿病腎病模型針對糖腎方開展了系列實驗研究，證實了糖腎方在降低24 h尿蛋白排泄、改善腎臟組織病理損傷方面均顯著優于陽性對照藥蒙諾/安博維，為臨床試驗結論提供了強有力的實驗支撐依據。

我們從日本引進了與人類糖尿病進展特點和病理特征比較相似的自發性2型糖尿病動物模型—OLETF大鼠，該鼠早期以胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂為主，以后逐漸出現胰腺功能減退，晚期合并糖尿病腎臟病變。研究發現，糖腎方對肥胖OLETF大鼠能減輕體重，降低血糖，減少24 h尿蛋白排泄，改善腎小球硬化及小管間質間質纖維化損害[11]，降低血清中白介素-10（interleukin-10，IL-10）和腫瘤壞死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）等炎癥介質[12]，改善TC水平和磷脂水平[13]，減輕肝臟損傷[14]，表明糖腎方在改善糖尿病肝腎損害的同時，也在一定程度上糾正了其脂代謝的紊亂。

采用高脂飲食合并小劑量鏈尿佐菌素成功誘導了類似于2型糖尿病伴脂代謝紊亂的大鼠模型，基于此模型給予糖腎方治療20周觀察其對大鼠肝腎損害的影響。結果表明：糖腎方也降低了模型大鼠的尿白蛋白排泄和減輕了腎組織病理損害，抑制了腎臟炎癥因子IL-1β及TNF-α mRNA及蛋白的表達[15]。而且，糖腎方對谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT又稱 ALT）、谷 草 轉 氨 酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT又稱AST）異常升高也有明顯降低作用，明顯減輕模型大鼠肝組織病理改變[16]。

團隊繼而采用10周齡自發性2型糖尿病db/db小鼠為模型組，同周齡db/m小鼠為對照組，連續給予糖腎方12周。結果顯示[17]，糖腎方治療組db/db小鼠血清ALT和AST水平顯著低于非治療組，說明糖腎方對糖尿病引起的肝功能損害具有保護作用。肝臟HE染色結果表明，db/db非治療組肝細胞索排列紊亂，肝細胞腫脹，體積較正常增大，嚴重者胞質疏松，且匯管區及中央靜脈周圍脂肪變性明顯。糖腎方治療組肝小葉結構完整，肝細胞排列尚整齊，肝細胞無明顯脂肪變性，脂肪病變程度評分顯著減少。油紅O染色結果發現，db/db小鼠肝組織大量油紅沉積，而糖腎方治療后脂滴變小，數量變少，進一步驗證糖腎方能夠顯著減少肝臟脂質沉積。

3 糖腎方改善糖尿病脂代謝紊亂防治肝腎損害的分子機制研究

圖1 糖腎方改善糖脂代謝“肝腎同治”研究思路圖

脂代謝紊亂與胰島素抵抗、多種細胞因子異常分泌、糖原沉積、氧化應激、AMPK活化等諸多因素密切相關。最近的研究顯示，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的激活在上述因素介導的脂代謝紊亂中發揮著核心作用，是導致糖尿病脂代謝紊亂的關鍵環節[18]。核轉錄因子κB（nuclear factor-κB）信號通路驅動的炎癥反應在腎臟病發生發展中具有重要作用，而mTOR一方面通過激活Akt啟動NF-κB信號通路，另一方面通過激活IKK激酶，降解IκB從而激活NF-κB。同時NF-κB激活釋放的炎癥介質CRP、IL-6及TNF-α等能夠激活mTOR，從而進一步加劇脂代謝紊亂。肝腎纖維化是糖尿病脂代謝紊亂介導肝腎損害的主要病理特征。眾所周知TGF-β1/Smad3信號通路是肝腎纖維化的關鍵機制。TGF-β1通過促進Smad3轉錄入核從而促進膠原沉積。最新研究發現mTORC1在這一過程中扮演重要作用。雷帕霉素能夠有效阻斷Smad3引起的膠原沉積[18]和TGF-β1誘導的纖維化。此外，在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型中，阻斷mTOR能夠顯著降低腎臟TGF-β1表達，減少腎小球細胞外基質積聚，提示mTOR是其關鍵環節[19]。基于上述理論以及糖腎方有效改善肝腎炎癥和纖維化的療效特點，本團隊提出科學假說：糖腎方改善糖尿病脂代謝紊亂防治肝腎損害的一個主要分子機制是通過調控mTOR信號通路，抑制NF-κB驅動的炎癥反應和TGF-β1/Smad3通路介導的纖維化實現（圖1）。

基礎研究證實，糖腎方顯著下調DN模型動物腎組織NF-κB p65磷酸化水平，減少單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和 IL-1β表達，顯著降低模型大鼠腎組織TGF-b1/Smad3信號通路以及I型膠原和IV型膠原水平，上調db/db小鼠腎臟中過氧化物酶體增殖劑激活受體ɑ（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARɑ）及其輔助激活因子-1α（PPARγcoactivator-1α，PGC-1α）、肝X 受體（liver X-activated receptor，LXR）和ATP結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）蛋白和mRNA水平，減少腎臟脂質沉積[20]。

糖腎方可顯著上調db/db小鼠肝組織腺苷一磷酸激活蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）的磷酸化水平及抑制轉錄因子膽固醇調節元件結合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP1）的表達及入核，從而顯著下調其下游脂肪酸從頭合成靶分子和膽固醇合成關鍵酶蛋白及基因水平；進一步發現，糖腎方可顯著增加db/db小鼠肝組織PI3K/Akt蛋白水平和減少p-mTOR水平，提示糖腎方可一定程度改善肝組織胰島素抵抗與mTOR介導的脂質沉積。從而系統揭示了糖腎方改善脂代謝紊亂肝腎同治的科學內涵[17]。

4 糖腎方化學成分分析與鑒定研究

為了進一步挖掘糖腎方的物質基礎，團隊利用化學物質組學方法建立了建立了糖腎方整體化學物質指紋圖譜，運用現代色譜及色譜質譜聯用技術對糖腎方進行了系統的化學成分研究，通過HPLC-DAD-TOFMS等色譜分析手段，結合相關文獻，鑒定出糖腎方中的51個成分，主要為皂苷類、有機酸類、黃酮類等成分，各類成分在藥材中的分布具體為：15個來源于山茱萸的有機酸及黃酮類成分、10個來源于三七的皂苷類成分、12個來源于鬼箭羽的黃酮類及有機酸類等成分、4個來源于枳殼的黃酮苷類成分、10個來源于黃芪的黃酮類及皂苷類成分。

5 討論

具有“益氣柔肝、活血通絡”功效的糖腎方改善脂代謝保護肝腎功能的機制研究是中醫基礎理論、現代文獻研究、臨床RCT研究和分子生物學研究綜合運用的成果，體現了“病-癥-方-效-理”研究思路，實現了臨床-實驗室-臨床的轉化，為中醫藥現代化研究提供了良好示范。

目前西醫對NAFLD和DN均采用綜合治療方法，都要求調整基本生活方式如合理飲食適當運動，減輕體重。該治療措施對疾病早期有一定的療效，可以延緩疾病的進展，然而，對中晚期病變，特別是臟器出現硬化和纖維化階段尚無有效的治療藥物。同時，多種、大劑量藥物的服用，給肝腎本身帶來了極大的負擔及損害。糖腎方的優勢特色在于系統改善機體脂代謝紊亂，同時發揮保護肝腎功能的功效，而且副作用較小。

本團隊已經從糖脂代謝紊亂、炎癥和纖維化三個層面揭示了糖腎方。然而，糖腎方調控上述通路的具體分子靶點是什么？能否采用RNA-seq的方法，進一步挖掘糖腎方新的分子靶點以及上述三條通路之間發生聯系的潛在分子。上述科學問題的解決將進一步闡明腎方肝腎同治的科學依據，豐富中醫肝腎同源理論的科學內涵。