基于氣質聯用的保元湯抗缺氧作用代謝組學研究＊

楊 茜，黃榮清，肖炳坤，楊建云

（軍事醫學研究院放射與輻射醫學研究所 北京 100850）

保元湯由人參、黃芪、甘草、肉桂四味中藥材組成，其中人參、黃芪為我國傳統滋補養生的名貴藥材，具有大補元氣、復脈固脫、生津養血等功效[1]。甘草可補脾益氣、緩急止痛，調和諸藥[2,3]。肉桂引火歸元，溫腎助陽，是一味性大熱的中藥材[4,5]。保元湯方以人參、黃芪大補元氣，扶助心氣；甘草炙用，甘溫益氣，通經利脈，行血氣；肉桂辛熱補陽，溫通血脈，是常用的補氣名方之一[6]。《張氏醫通·祖劑》中對此方高度評價，將此方稱為補氣諸方之首[7]。后世醫家也以保元湯方劑為本，形成諸多衍化方，其影響力可見一斑。

代謝組學是近年來快速發展的一門新學科，它的研究對象是代謝組在某一時刻或某種狀態下細胞內所有的代謝物變化情況等，通過考察生物體受到外界刺激或給藥前后時點狀態，研究代謝產物圖譜動態變化的整體情況[8]。通過了解這些代謝組小分子物質在不同條件不同時點下的量變，有助于理解整個動態生理變化過程，以此來研究一些疾病發展、藥物治療以及毒理機制等[9-11]。代謝組學將代謝組作為一個整體來進行研究，與中藥方劑中整體性和動態性原則十分相似，對于成分復雜的中藥方劑來講，代謝組學的研究方法無疑為方劑研究提供了全新研究思路[12,13]。

本實驗以代謝組學為基本思路，利用氣相色譜質譜（GC-MS）聯用技術，對保元湯在KM小鼠常壓耐缺氧模型中的干預作用進行研究，探討并闡述保元湯在該模型中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 藥材

保元湯全方：紅參（北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，批號701002387A），黃芪（北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，批號170510），炙甘草（北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，批號170510），肉桂（北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，批號160116）

1.2 實驗動物

選取雄性昆明種小鼠體重18～20 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，合格證號SCXK-(軍)2012-0004。

1.3 實驗儀器與試劑

1.3.1 實驗儀器

旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），LGJ-25C冷凍干燥機(北京四環科學儀器有限公司)；Media Water Purifier凈水機（佛山市美麗清湖凈水設備有限公司）；DL-1-15高級臺式封閉電爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHZ型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴槽（上海亞榮生化儀器廠）；QL-901Vortex型渦旋儀(其林貝爾儀器制造有限公司)；BP211D型天平(德國Sartorius公司)；NV-15G型氮吹儀（成都賽斯特儀器儀表有限公司）；IDZ5-2型離心機（上海安亭科學儀器廠）；GC/MS—QP2010SE氣相-質譜聯用儀(日本島津公司)；BC-2600全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）。

1.3.2 試劑

乙腈（賽默飛世爾科技（中國）有限公司)；甲醇(賽默飛爾科技（中國）有限公司)；甲氧氟鹽酸鹽（sigma公司）；BSTFA+TMCS(99：1)(sigma公司)；吡啶（天津市博迪化工有限公司）；庚烷(梯希愛（上海）化工生產發展有限公司)；

1.4 實驗方法

1.4.1 保元湯煎劑制取

取紅參150 g，黃芪225 g，甘草（炙用）75 g，肉桂37.5 g，加入10倍量水浸泡過夜后煎煮1 h，用紗布過濾后收集濾液，第二次和第三次煎煮分別加入5倍量水和3倍量水，煎煮30 min，同樣以紗布過濾收集濾液，合并三次濾液，旋蒸濃縮后置于凍干機進行凍干，獲得保元湯煎劑凍干粉末。

1.4.2 保元湯對小鼠抗缺氧能力干預

將64只小鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、陽性對照組（普萘洛爾灌胃給藥0.520 mg·kg-1）、保元湯低劑量組（水煎液84.5 mg·kg-1）、保元湯中劑量組（水煎液254 mg·kg-1）、保元湯高劑量組（水煎液507 mg·kg-1），每組8只。每日灌胃1次，連續12 d。末次灌胃1 h后，將各組小鼠分別放入盛有15 g鈉石灰的250 mL具塞廣口瓶內，用凡士林涂抹瓶塞密閉瓶口后，立刻開始計時，直至小鼠呼吸停止時間。以該時間為指標，比較各組小鼠的常壓抗缺氧能力。將呼吸停止后的小鼠進行腹主動脈取血，12000 rpm·min-1離心后獲得血清待衍生化后進行GC-MS分析。

1.4.3 血常規分析

將呼吸停止后的小鼠立即腹主動脈取血10 μL，放入血液分析儀配套稀釋液中稀釋并搖勻，直接使用血液分析儀進樣分析，得到血常規分析數據。

1.4.4 GC-MS分析

前處理（衍生化）：吸取血清100 μL至2 mL EP管中，加入1200 mL甲醇，渦旋1 min后超聲15 min，放入離心機以12000 rpm·min-1離心15 min，去除血清中蛋白。取200 μL上清液至2 mL玻璃小瓶后放入氮吹儀，60℃溫度下進行氮氣吹干。吹干后加入50 μL的20 mg·mL-1甲氧氟吡啶試劑，渦旋30 s復溶，隨后放入70℃水浴加熱1 h進行肟化處理。水浴后冷卻至室溫，加入硅烷化試劑BSTFA+TMCS(99∶1)試劑75 μL，渦旋30 s混勻后，再次放入70℃水浴中加熱1h進行衍生。水浴后再次冷卻至室溫，加入100 μL庚烷，渦旋30 s混勻，過0.2 μm濾膜后得到衍生樣品，待GC-MS上機分析。

GC-MS條件參數設定：儀器使用自動調諧方式進行調諧。設定參數：接口溫度：280℃；離子源溫度：230℃；電離方式為EI源，轟擊能量70 eV；倍增電壓：1.0 kV；掃描方式：全掃描。色譜柱：RESTEK RX-5 Ms(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；載氣：氦氣；流速：1.0 mL·min-1，分流進樣；進樣口溫度：280℃；進樣體積：1 μL；升溫程序：80℃（0 min）→80℃(5 min)→300℃(60 min)→300℃(70 min)。

1.4.5 代謝標志物尋找及代謝通路分析

將正常組與模型組GC-MS數據使用XCMS預處理后，導入SIMCA-P11.5進行變量權重分析（VIP值），篩選VIP值＞1.5的變量。結合荷質比與保留時間參數，導入GC-Solution(NIST2008質譜數據庫)中確認潛在標志物化學結構，并通過檢索Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）和 Human Metabolome Data－base（HMDB）在線數據庫確認代謝標志物結構。同時，將篩選出的代謝標志物使用SPSS 22.0進行t檢驗，排除不具有顯著性差異（P＞0.05）的變量。最終確認生物標志物后，將其導入MetaboAnalyst在線分析代謝通路。

表1 保元湯對常壓缺氧小鼠死亡時間影響表（x±s，n=8）

表2 RBC、HBC、HCT分析結果對比表

圖1 正常組、模型組、高劑量給藥組及陽性對照組TIC圖

2 結果與分析

2.1 常壓抗缺氧實驗不同組別小鼠死亡時間

各組別小鼠死亡時間如表1所示，對各組小鼠常壓抗缺氧死亡時間進行分析，與模型組相比較，保元湯低劑量組具有顯著差異（P＜0.05），保元湯中劑量組和高劑量組、陽性對照組具有極顯著差異（P＜0.01），保元湯不同計量組死亡時間有上升趨勢，但組間無顯著性差異。同時保元湯各個劑量組與陽性對照組無顯著性差異，即保元湯與普萘洛爾具有相同常壓抗缺氧作用，造模成功。

2.2 血常規分析

通過血液分析儀對白細胞數目WBC、淋巴細胞數目Lymph#、單核細胞數目Mon#、中性粒細胞數目Gran#、紅細胞數目RBC、血紅蛋白HBC、紅細胞壓積HCT、血小板數目PLT進行分析比較，其中RBC、HBC、HCT三項空白組和模型組出現顯著性差異，同時模型組與不同劑量給藥組間出現差異，結果如表2所示。

分析各組小鼠在RBC、HBC、HCT數據差異，保元湯低劑量組雖出現數值上升，但與模型組相比，無顯著性差異。而給藥中劑量和高劑量組與模型組相比，則分別體現出顯著性差異和極顯著性差異，陽性對照普萘洛爾在該項目中變化不大。

圖2 正常組與模型組OPLS-DA分析結果

2.3 GC-MS分析結果

按照1.4.4所述方法，將各組小鼠血清衍生前處理后，使用GC-MS進行分析，正常組、模型組、高劑量給藥組及陽性對照組總離子流圖（Total Ion Current,TIC）（圖1）。

2.4 代謝組學分析

2.4.1 正常組與模型組OPLS-DA分析結果及潛在代謝標志物尋找

圖3 不同計量組PLS-DA分析結果

圖4 代謝分析影響值圖

正常組與模型組血清樣品GC-MS分析結果經XCMS處理后，將數據導入SIMCA-P11.5分離分析，R2X=0.689，R2Y=0.991，Q2=0.907，排除過渡擬合現象。正常組與模型組分開（圖1），根據VIP值大于1.5初步篩選確認47個潛在的標志代謝物。

2.4.2 保元湯對小鼠常壓抗缺氧作用

保元湯各劑量組干預小鼠常壓抗缺氧模型后，將GC-MS分析數據導入MetaboAnalyst4.0進行PLS-DA分析，（圖2）。保元湯三個劑量組有交叉部分，但高劑量組明顯與空白組更為接近，證明保元湯劑量與小鼠常壓抗缺氧作用相關，高劑量給藥組干預作用最強。

表3 代謝標志物及峰面積比較表

2.4.3 代謝物標志物獲取及峰面積比較

在2.4.1初步分析基礎上，進一步對潛在代謝標志物進行篩選。通過比對GC-MS的總離子流圖（TIC圖），同時通過SPSS軟件篩選具有統計學差異的峰，最終共發現25個內源性代謝標志物，分別為丙氨酸、乳酸、1-苯乙胺、甘氨酸、β-丙氨酸、異亮氨酸、乙酰甘氨酸、氨基丁酸、二甲基甘氨酸、絲氨酸、二乙胺、乙醇胺、酪胺、色胺、乙胺、蘇氨酸、2,3-丁二醇、琥珀酸、蘇糖酸、β-甘油磷酸、N-乙酰-L-賴氨酸、丁胺、赤蘚糖、巖藻糖、肌醇-1-磷酸。該25個代謝標志物在正常組、模型組、對照組和高劑量給藥組峰面積變化表如表3所示，模型組與正常組相比，代謝標志物峰面積均存在顯著性差異（P＜0.05）或極顯著性差異（P＜0.01）。高劑量給藥組與正常組相比，除異亮氨酸與二甲基甘氨酸顯著性升高外，其余各代謝標志物均無顯著性差異，意味著高劑量給藥組已恢復至正常水平。

2.4.4 代謝通路分析

將2.4.3中發現的代謝標志物導入MetaboAnalyst4.0中進行代謝通路在線分析，得到29條通路分析詳細結果，通路分析影響值如圖3所示。綜合Impact＞0.1及相關文獻分析，保元湯干預小鼠常壓抗缺氧模型最密切的4條代謝路徑分別為①甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝路徑（Glycine,serine and threonine metabolism），②氨酰-tRNA合成(AminoacyltRNA biosynthesis)，③纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝路徑（Valine,leucine and isoleucine biosynthesis 2），④β-丙氨酸代謝路徑（beta-Alanine metabolism）。

3 討論

小鼠常壓抗缺氧實驗建立在將小鼠置于密閉環境下，隨著小鼠對氧氣的消耗和瓶中二氧化碳體積分數的增加，最終造成小鼠缺氧后呼吸中樞抑制而死亡，同時腦和心臟缺血也是死亡的重要原因[14]。本實驗以保元湯灌胃給藥干預后，各劑量給藥組小鼠死亡時間均有顯著性延長，對其可能機制進行分析如下：

首先，在血常規分析中可明顯看到保元湯中、高劑量給藥組在紅細胞數目RBC、血紅蛋白HGB、紅細胞壓積HCT上的明顯升高。紅細胞是哺乳動物體內血液運送氧氣的主要媒介，其數量的增多必然有利于增加血液的運氧能力[15]。紅細胞中含有的血紅蛋白是由珠蛋白和亞鐵血紅素結合而成，同樣在血液的氣體運輸中起到重要作用[16]。紅細胞、血紅蛋白的增高，整體上均有利于血液攜氧，是保元湯具有顯著抗缺氧效應的原因之一。

其次在血清GC-MS代謝組學分析中，最終得到的代謝標志物主要集中在氨基酸類小分子物質變化上。根據周軍利[17]等的研究，甘氨酸對缺氧大鼠心肌細胞具有一定保護作用，可能機制為甘氨酸與心肌細胞內受體結合，減輕心肌細胞膜去極化，從而減少Ca2+通道開放使Ca2+內流減少，發揮保護作用。在空白組與模型組對比中也發現，模型組血清中甘氨酸濃度明顯下降，可能也與這一作用有關。

氨酰-tRNA合成通路變化則提示了氨基酸體內合成的變化情況。在生物體內轉錄翻譯過程中，tRNA分子會與相應的氨基酸結合，然后將其運送至核糖體進行蛋白質合成。在連接反應中，首先在酶的作用下，ATP與氨基酸結合并消耗能量釋放焦磷酸，形成氨酰-AMP復合物，接下來該復合物與對應tRNA結合并運輸。氨基酸與tRNA之間形成被稱作氨酰-tRNA鍵的高能鍵，在蛋白質合成的轉運過程中發揮重要作用[18]。因此，如果氨酰-tRNA合成發生障礙，則必然會影響到蛋白質合成。本研究中甘氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸代謝產物變化，提示常壓抗缺氧模型中可能存在涉及蛋白質翻譯過程的變化。

此外，代謝標志物中的β-丙氨酸是牛磺酸轉運體抑制劑，可與Tau-T競爭性結合，抑制牛磺酸轉運。而牛磺酸作為人體一種具有特殊生理功能的氨基酸，有一定對心肌細胞的保護能力[19,20]，在抗缺氧能力中也發揮著一定作用。