化妝品功效評價（XI）
——體外試驗技術在發用化妝品功效評價中的應用

何文丹 ，劉 磊 ，楊舒顏 ，唐 穎

（1.北京工商大學 理學院 化妝品系，北京 100048；2.北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京 100048）

發用化妝品包括育發、染發、燙發類的特殊用途化妝品和清潔、護發類的非特殊用途化妝品。它們的作用對象包括毛發及其賴以生長的皮膚區域（頭皮）。發用化妝品的品種繁多，功能和作用機理各異。例如洗發水用于清潔頭發和頭皮，護發素用于保護頭發纖維并提供理想的外觀和觸感，這些產品主要改變頭發表面的粗糙度、摩擦和粘附性能，而染發和燙發產品則主要通過改變頭發內部的化學成分及相關物理性質來實現其功能。近年來，我國發用化妝品行業發展迅速，市場競爭激烈，而消費者日趨理性，對產品功效越來越重視。如果化妝品功效宣稱缺乏充分的科學依據，勢必影響產品的市場推廣。因此，如何運用生物學、化學和物理學手段對發用化妝品的不同功效進行科學表征和評價，是發用化妝品研發的重要課題，也是化妝品行業十分感興趣的問題。

目前對化妝品的功效評價主要通過體內試驗和體外試驗兩種技術途徑實現。體內試驗以動物試驗和志愿者人體試驗為主，還包括了人體感官和主觀性評價。體外試驗主要通過離體培養的細胞、微生物和組織等體外生物學模型進行。此外，由于頭發的發干部分是由無生命的蛋白質纖維構成，發用化妝品的體外評價還可以采用以波譜學、理化分析為代表的材料學儀器分析。2013年歐盟全面禁止化妝品動物試驗禁令的提出，推動了體外試驗技術在化妝品評價領域的發展與進步。與此同時，相對于試驗周期長、成本高、主觀性強的傳統動物試驗和人體試驗，體外試驗在評價時還具有試驗周期短、經濟簡便和易于開展深層次機理研究等優點，因此越來越受到行業和消費者的重視。

根據作用部位的不同，可以將發用化妝品分為作用于頭發纖維和作用于頭皮兩類。對于作用部位在頭發纖維的大多數發用化妝品（包括清潔、修復、漂染、定型等），其功效評價主要針對頭發纖維的形貌、結構、化學成分和機械性能等的改變；而對于作用部位在頭皮的發用化妝品（如去屑、育發），其功效評價主要通過體外生物學模型進行。

1 針對頭發纖維的體外評價

人的頭發纖維直徑為50～100 μm，由角質層、毛皮質和毛髓質三部分組成。最外層的角質層覆蓋著毛鱗片，構成了毛發表面約5 μm厚的保護層。最內側區域的毛髓質厚度為5～10 μm，由中空細胞組成。位于毛發中間區域的毛皮層（約45～90 μm）是毛發主要的結構支撐部分，由長圓柱形組裝的皮質細胞和細胞膜復合物（CMC）組成。皮質細胞由卷曲螺旋的α-角蛋白和角蛋白締合蛋白（KAP）橫向組裝成的微纖維和間質材料構成[1]。頭發纖維由無生命的死細胞構成，因此，針對頭發纖維的體外評價主要運用多種材料學和生物物理學儀器分析手段開展，包括顯微成像分析、光譜、蛋白質組質譜、機械張力和摩擦力學等分析方法。

1.1 顯微成像分析

運用各種顯微成像技術可方便地對頭發纖維的微觀結構進行觀察，并對包括化妝品、光照、機械損傷、干燥等對毛發的影響進行評估。

1.1.1 掃描電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）是一種在真空下利用聚焦電子束掃描能夠使樣品表面產生放大和清晰圖像的成像技術[2]。利用SEM可以對頭發纖維的微觀結構和形態學變化進行直接觀察，是對頭發進行顯微成像分析最常用的方法。例如頭發纖維表面毛鱗片的形態容易受到光照、風化和梳理的影響，而發梢與發尾通常存在明顯的老化差異。2010年巴黎歐萊雅集團（中國區）用SEM對一名女性的4.3 m長發的發根、中間部分和發尾部分進行觀察，發現毛發根部的毛鱗片組織結構完好，中間部分的毛鱗片翹起、邊緣變得粗糙，而發梢的毛鱗片已經完全脫落，直接暴露了毛皮質[3]。SEM還能觀察發用化妝品處理對頭發微觀結構的影響，從而對其損傷或修復功能進行定性或半定量評價。韓國延世大學的Ahn等[4]曾報道了一項永久性染發劑對毛發損傷的SEM研究，發現未染色的毛發具有完整而致密的毛鱗片，毛發表面均勻有光澤，而染發的毛鱗片則變得破碎、剝離和脫落。2012年，西班牙學者Fernández等[5]通過SEM觀察發現使用朝鮮薊提取物制備成的護發劑對頭發表面毛鱗片在老化過程中的翹起有改善作用，因此認為該提取物具有護發功效。

1.1.2 透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）是將經加速和聚焦的電子束投射到非常薄的樣品（一般需要切片）上，利用電子與樣品中的原子碰撞產生立體角散射而成像的一種顯微成像技術。該系統是由封裝在低壓抽空柱子中控制光束的電磁透鏡組成的發射電子源，當電子束通過樣品時，由于衍射電子束的角度分布而形成可觀察的圖像。利用TEM可以觀察頭發纖維內部橫截面的超微結構。在上述Ahn等[4]的研究中，還同時應用TEM觀察永久性染發劑染發引起毛發表層在橫截面上的變化，發現染發導致的結構損傷（表現為角質層細胞的破碎和空洞化）在6～24 h內最嚴重，需要8周才能恢復到未染發狀態，因此建議消費者補染發的間隔為8周時間[4]。類似的，2016年巴西的一項利用TEM分析毛發內部結構的研究也觀察到了頭發在紫外線輻射和水洗過程中的微觀結構損害，認為光照和過度清洗都會使毛發變得脆弱[6]。而韓國的一項TEM研究表明，在護發產品中添加原花青素低聚物可以減緩漂染處理中毛發皮質中黑素小體和蛋白質的降解[7]。

1.1.3 原子力顯微鏡

原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）是通過探針與被測樣品之間的微弱的相互作用力即原子力來獲得物質表面形貌的信息，從而獲得納米尺度顯微成像的技術。AFM由于具有超高圖像分辨率、測試和樣品制備時的簡易性（無需SEM和TEM時的噴金制樣和高真空條件），在局部的三維拓撲成像時具有獨特的優點。在過去的20年里，AFM被廣泛地應用于研究頭發角質層的各種微納結構（如A層、外表皮、內皮細胞和細胞膜復合物），并用這些數據來比較研究環境因素和化妝品處理對頭發粗糙度和摩擦力學性質的影響，從而對產品的護發效果進行評價。如Chen等[8]利用AFM的不同模式對頭發表面上的護發素的分布、厚度與頭發摩擦力學性質之間的關聯性進行研究。AFM還可以用來表征毛發纖維的各種物理特性，如摩擦力、附著力、磨損、彈性剛度和黏彈性等納米力學性能。2013年，英國樸茨茅斯大學使用AFM圖像確定了頭發表面亞結構的微尺度摩擦系數、尖端-表面粘附力和相應的粘附能量值[9]。另一項研究[10]通過AFM成像表征了頭發纖維的納米楊氏模量，并發現漂白后毛發表面的模量降低，表現為纖維彈性下降。

1.1.4 光學相干斷層掃描

對頭發纖維截面的高分辨率圖像分析還可以通過光學相干斷層掃描（Optical coherence tomography，OCT）進行。OCT利用低長度相干干涉測量的原理，通過設備的直接相干反射光子獲得具有高分辨率層析成像的生物結構圖像[11]。2014年，巴黎歐萊雅集團（美國區）使用X射線斷層顯微鏡研究了非裔美國女性毛發斷裂情況，發現當頭發纖維拉伸超過30%后，毛發的橫截面積（尤其是斷裂發生的部位）明顯減小[12]。此外，由于OCT可以分析毛發在相同部位由外界因素引起的結構和形態學變化，具有對同一部位的變化進行精確比較、減小測量誤差的優點。2016年，巴西圣保羅大學報道了使用OCT觀察氧化型染發劑染發引起同一部位毛發的超微結構變化，研究發現染發后毛發的散射系數和折射率增加，而毛髓質和毛皮質的OCT圖像清晰度降低，從而判斷髓質和皮質結構受損[13]。

1.2 光譜分析

光譜分析是根據物質的光學特性，鑒別物質及確定其化學成分的技術。目前在發用化妝品功效評價中最常用的是紫外可見光譜、熒光光譜、紅外光譜和拉曼光譜。

1.2.1 紫外可見光譜

紫外可見光譜（UV-Visible spectroscopy）包括紫外可見光區域（320～780 nm）的漫反射光譜（Diffuse reflectance spectroscopy，DRS）和吸收光譜（Absorption spectroscopy，AS）。漫反射光譜反映了物質在紫外可見光波段的反射率，常用于判斷樣品的色彩和明暗度。通過將放射率數值轉換為CIELab色彩空間，漫反射光譜可用于定量評價染護發產品處理后頭發纖維的光澤和顏色變化。2016年，北京工商大學唐穎[14]通過漫反射光譜研究了包括自然白/黑發、灰發和漂染發等不同類型的中國人頭發在UVA光老化中的顏色變化，結果發現，不同類型的頭發對紫外輻射的敏感程度和光變色反應具有明顯差異，漂染過的頭發表現出光變暗，而自然白發表現出光黃化。而Dario等[15]的一項研究發現，將石榴提取物復配成護發素可以有效減少染發在光老化中的顏色變化。吸收光譜反映了物質生色團在可見光波長范圍內的吸收特征，常用于染料或吸光物質的定量分析。2014年，Pires-Oliveira等[16]通過分析毛發提取物溶液的吸收光譜，比較研究了4種表面活性劑引起的毛發損傷，發現吸收峰面積與毛發降解得到的黑色素顆粒和蛋白質成分成正比，建立了對毛發損傷進行表征的分光光度法。

1.2.2 熒光光譜

熒光光譜（Fluorescence spectroscopy）是指利用某些熒光物質在紫外光照射下產生熒光的特性進行物質的定性或定量分析的方法。頭發角蛋白中的氨基酸如色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸都是熒光基團，因此可以通過熒光光譜評估頭發中蛋白質成分的降解以及護發產品中功效成分對毛發的保護作用。2012年，Estibalitz等[17]發現通過對頭發中色氨酸熒光強度的監測可定量毛發的光損傷；并在此基礎上發現使用大米提取物制備成護發素對頭發具有光防護作用[5]。除了二維發射光譜對色氨酸進行定量檢測外，還可以利用三維熒光光譜得到指紋圖譜對頭發纖維中存在的多種氨基酸及其氧化產物同時進行分析，來鑒別不同化妝品處理過的頭發類型及其光老化規律[14]。

1.2.3 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT IR）由化合物的分子振動能級在吸收紅外光照后發生躍遷而產生，包含了化合物的官能團、結晶態等結構信息。將FT IR與ATR衰減全反射相連，可直接對頭發纖維進行測量，利用紅外光譜的指紋特征性評估不同化妝品處理（如保濕、漂白和染色等）對頭發角蛋白分子結構和形態的影響[18]。2016年，北京工商大學唐穎等[14]通過FT IR指紋圖譜對不同漂染處理后的頭發樣本進行分析，發現UVA和過氧化氫可以使毛發中胱氨酸的二硫鍵斷裂，產生半胱氨酸，而后者易被氧化產生大量磺基丙氨酸。由于頭發表面胱氨酸含量相對恒定（約11%～18%），因此磺基丙氨酸可用來監測高硫蛋白的氧化程度。

1.2.4 拉曼光譜

拉曼光譜（Raman spectroscopy，RS）是利用化合物受光照射后發生振動產生的非彈性散射光譜（“拉曼效應”），對物質的組成和分子結構進行定性和定量分析的技術。對頭發纖維拉曼光譜的測量，可以反映蛋白質主鏈的骨架振動、氨基酸的側鏈構象與存在形式以及外部環境變化引起的微小改變（S-S的構象和蛋白質分子的二級結構等）[19]。2006年—2010年，日本中央研究實驗室通過一系列基于拉曼光譜的機制研究，探討了老化和漂染等對毛發在黑色素含量、蛋白質纖維結構和抗拉強度等方面的影響[20，21]。他們通過直接分析不同年齡、不同處理（漂白發或黑色頭發）在不同深度橫截面的拉曼光譜，發現隨著年齡的增長，毛發皮質區黑色素顆粒含量減少[22]；而漂白處理后毛發中的二硫鍵從角質層到皮質層的含量降低，同時半胱氨酸含量增加，此外，漂粉中的氧化劑還促進了頭發皮質中黑色素顆粒的分解，使黑發在漂白過程中二硫化物基團的裂解水平更高[23]。

1.3 色譜

色譜（Chromatography）分析是按物質在固定相與流動相間分配系數的差別而進行分離、分析的技術。在評價化妝品對毛發的損傷程度時，常利用色氨酸對蛋白質成分的損失進行定量評估，而用熒光分光光度法定量色氨酸容易受到檢測系統中其他熒光物質的影響。2017年，Dario等[24]開發了一種使用具有熒光和UV檢測的高效液相色譜法（HPLC），在毛發樣品堿水解后對色氨酸和光氧化物犬尿氨酸進行定量檢測的方法。結果表明，漂白和染色過程會導致蛋白質/氨基酸的損失，但色氨酸不會在毛發的光老化中大量降解。Khumalo等[25]將頭發經過鹽酸水解后結合氨基酸分析儀進行色譜分析，發現受損的毛發中的精氨酸、瓜氨酸和胱氨酸含量降低，谷氨酰胺水平增加。此外，色譜還常與質譜聯用，廣泛用于化妝品中的功效成分或禁限用成分的定量檢測。

1.4 質譜

質譜（Mass spectrometry，MS）是將被測物質離子化，按離子的質荷比分離，通過測量各種離子譜峰的強度而實現分析目的的一種分析方法。毛發中的角蛋白和角蛋白締合蛋白（KAP）賦予了毛發重要的結構和機械性能。基于蛋白質組學的質譜技術可以通過鑒定毛發中存在的所有角蛋白和主要KAP中氨基酸基團的修飾變化，從而對不同化妝品處理或環境因素對毛發纖維蛋白質的影響進行表征。2013年，新西蘭農業研究所Dyer等[26]使用LC-MS/MS鑒定堿處理、漂白處理前后毛發樣品中蛋白質含量變化，結果表明堿處理會輕微增加毛發的氧化損傷程度，而漂白處理對毛發角蛋白（主要是半胱氨酸）造成明顯的氧化損害。2016年，北京工商大學和Dyer合作采用此技術分析中國人的常染發人群的頭發樣本，發現染發的蛋白質氧化水平比未染發增加了近1.6倍，因此常染色的毛發更容易受到日光損傷[27]。

1.5 熱分析

熱分析是在程序控溫下，測量物質的物理性質隨溫度變化的一類技術，包括熱重分析（TG）、衍生熱重分析（DTG）、差熱分析（DTA）和差示掃描量熱法（DSC）。其中，DSC常用于角蛋白變性溫度以及角蛋白變性焓的測定[28，29]。近年來，DSC越來越多地用于護發產品的功效評價。2011年，Rigoletto等[30]通過DSC評估毛發角蛋白降解和評價化妝品對損傷毛發的修復效果。結果表明，隨著熱處理溫度從205 ℃上升到232 ℃，角蛋白的變性溫度和變性晗均顯著下降，蛋白質降解更加嚴重，而使用聚合物（月桂基甲基丙烯酸酯共聚物、聚季銨鹽-55等）對毛發進行處理后，可有效降低角蛋白的熱降解和減輕毛小皮損傷。2016年，花王研究發現當干發中的α-角蛋白發生變性和降解，濕發的DSC變性溫度反而降低，提出DSC還應與XRD、拉伸實驗等方法聯用以更好地理解化妝品對毛發的實際作用效果[31]。

1.6 機械性能分析

毛皮質中的α-角蛋白和二硫鍵決定了毛發纖維的機械性能（拉伸性和扭轉性）。與此同時，毛發的機械性能還受到各種環境因素的影響：相對濕度或溫度的升高會導致楊氏模量的降低和延展性的增加，而扭曲會對毛發纖維造成傷害，導致斷裂應力、斷裂應變和楊氏模量的降低[32]。對毛發的拉伸等機械性能分析可以利用美國英斯特朗INSTRON系列萬能材料測試儀、英國戴亞斯特隆公司（Dia-Stron） MTT拉伸試驗機等儀器進行測定，測試參數包括拉伸強度、斷裂應力、斷裂應變曲線、斷裂伸長率等[30-33]。Davis等[33]通過拉伸性測試和扭轉測試發現一個包含咖啡因、煙酰胺和泛醇的配方具有增強毛發拉伸力和柔韌性的功效。毛發纖維在外力作用下的拉伸性和扭轉性還與其柔韌性相關，除了護發產品，還可用于評價毛發造型類產品。例如，上海工程技術大學Yan等[34]通過測定一種聚氨酯聚合物涂覆后對毛發機械性能的影響，評價這種發用定型劑的形狀記憶效應和耐水洗性能。

1.7 梳理性能表征

毛發纖維的摩擦系數和彈性特性是毛發梳理性能中的重要物理參數。與毛發的摩擦學特性緊密相關的是其毛干表面的脂質（18-甲基二十烷酸）和角蛋白構成的毛鱗片。當毛發光老化或損傷后，脂質流失、毛鱗片變得翹起、剝落，就會導致毛發表面變得粗糙，摩擦系數上升，同時手觸摸時的柔軟度下降，毛發變得難以梳理或易打結。因此，表征毛發表面的摩擦學性質對于量化梳理性能和評估洗護發產品的功效十分重要。Chevalier[35]通過尼龍螺紋實驗得到了計算單根毛發的自摩擦系數方程，并用此測得濕發的靜摩擦系數明顯高于干發，還發現堿處理會導致毛發摩擦系數的不可逆增大。自20世紀50年代Roeder開發首個毛發靜摩擦力的測試方法以來，目前已有多種方法和技術可對毛發-毛發界面的摩擦力進行定量測定，包括Dussaud的“斜面法”和Luengo的“AFM懸臂法”等[35，36]，并出現了專門針對毛發的測試儀器，方便對發用化妝品梳理性能進行評價，如Dia-Stron MTT系列測試儀和亞什蘭公司的Aqualon SLT組件等。圣保羅大學Da等[37]使用Dia-Stron MTT175測試儀分析不同護發劑對染發后毛發的保護作用，結果表明含烷三醇和泛醇的配方可有效降低毛發的梳理阻力。

2 針對頭皮的體外評價

毛發的生長離不開頭皮上的毛囊組織。毛囊是頭皮的表皮向真皮處下陷而形成的重要的附屬結構，分為表皮層與真皮層兩部分。毛囊表皮層包括內根鞘（IRS）和外根鞘（ORS），內根鞘在皮脂腺開口處與內陷的表皮水平相連，起決定毛發形狀的作用。外根鞘形成突起的毛囊隆突區，含有多種干細胞，這些干細胞與附近的上皮細胞、內外根鞘、基底膜或者纖維細胞相互作用調控毛發的生長。對于作用部位在頭皮的育發、去屑類化妝品，主要通過人工培養的細胞、微生物模型和離體的毛囊組織來進行相關功效的體外評價。

2.1 細胞模型

育發類化妝品產品在功效評價時常采用真皮乳頭細胞、角質細胞和毛囊上皮細胞，通過受試物對細胞增殖的促進作用、細胞因子（如VEGF）和相關基因表達的變化等來衡量其功效成分對毛發增長的促進效果。韓國學者Rho等[38]報道了木香烴內酯（一種木香根中的倍半萜類提取物）可以刺激永生化的人頭皮毛囊真皮乳頭細胞（hHFDPC）的增殖，并在進一步的動物實驗中得到了驗證，表明該成分具有顯著的育發效果。永生化人角質細胞（HaCaT）和真皮乳頭細胞（DP）被廣泛地應用于育發和防脫發功效成分的篩選，多種植物提取物及化學合成物質在體外細胞和在進一步的動物實驗中得到了一致的結果[39-41]。此外，由于白發的產生被認為與高氧化壓力對黑色素的破壞有關，歐萊雅報道了采用過氧化氫損傷的人原代黑色素細胞模型用在烏發功效的評價上，如何首烏提取物被發現可有效抑制細胞內ROS水平升高和細胞凋亡，抑制氧化應激下黑色素的減少，從而起到烏發固色的作用[42]。

2.2 微生物模型

馬拉色菌（Malassezia）與頭皮屑的形成密切相關，頭皮上真菌主要為馬拉色菌，其中限制性馬拉色菌（M.restricta）和球形馬拉色菌（M.globaso）為優勢種屬[43]。因此，馬拉色菌抑菌試驗被廣泛應用于添加了抗菌成分的去屑洗發水的功效評價。德國拜爾斯道夫公司[44]報道了通過對馬拉色菌抑菌圈大小的測定，結合人體實驗，比較含有不同抗菌原料（如吡羅克酮乙醇胺、氯胺酮和吡啶硫酮鋅）洗發水的去屑功效。除了比較不同配方產品，馬拉色菌實驗還被廣泛應用于抑菌去屑功效原料的篩選。多篇文獻[45，46]報道了通過馬拉色菌最小抑菌濃度（MIC）的測定篩選出了具有良好去屑抑菌性能的植物提取物（如茶樹油、蘆筍根提取物等）。這些植物成分可以作為化學抗菌劑的天然替代品用在去屑化妝品中。

2.3 組織模型

組織模型包含從人或者動物分離培養的毛囊體外培養系統和商業化的3D皮膚模型。與細胞系相比，這類組織模型在三維結構和生理功能等方面更接近真實人體，一般認為在功效評價時具有更高的可靠性。因此，近年來，體外毛囊培養系統在國內外被廣泛應用于生發、育發藥品及其育發類化妝品的研究與開發。Park等[47]報道了使用離體培養的人毛囊組織研究雙-油酰氨基異丙醇（BOI）對毛發生長的影響，發現BOI處理能促進毛囊中的毛發生長并能將毛發的生長期由生長終期誘導轉化為生長初期。此外，組織模型還可以與外源微生物共培養，進行包括抗菌、去屑功效的評價。2013年，聯合利華報道了將馬拉色菌接種于VitroSkinTM皮膚模型上，發現復配有抗菌成分（吡啶硫酮鋅和甘寶素）的洗發水具有良好的去屑功效[44]。

3 發用化妝品體外功效評價方法匯總

與傳統的動物和人體試驗方法相比，以生物物理學儀器分析和離體生物學模型為代表的體外評價方法，具有經濟、簡便、快捷的優點，對于發用化妝品功效性原料的篩選、作用機理研究和配方的優化設計均具有重要的現實意義。表1總結了目前常用的發用化妝品的體外功效評價技術。其中，針對頭發纖維部位的評價主要采用無損或微損的儀器分析，評價化妝品處理后頭發纖維在顏色、亮度、微觀結構、蛋白質損失和力學特性等方面的變化。對于作用部位在頭皮的發用化妝品，其功效評價主要采用體外生物學模型。多種皮膚細胞、毛囊組織和微生物模型在育發、去屑類產品的功效評價中得到了廣泛的應用。

表1 常用的發用化妝品功效評價的體外試驗方法Tab.1 In vitro techniques commonly used for the efficacy evaluation of hair cosmetics

4 結語

發用化妝品功效復雜、種類繁多，單一的體外試驗方法很難對產品進行全面評價。化妝品評價人員需要在掌握產品功效成分和作用機制的基礎上，綜合運用多種體外方法，將不同靶部位、不同層面的試驗技術手段有機結合起來，才能實現對一款發用化妝品的多角度、系統性功效評價。與此同時，如何在已有體外方法的基礎上，開發出適合臨床的原位快速檢測毛發理化性質及成分變化的試驗技術也是未來發用功效評價發展的重要方向。