PolyI∶C復合物對小鼠體內非小細胞肺癌移植瘤的作用

吳葉丹，安昌善

延邊大學附屬醫院呼吸內科 吉林延吉133000

近年來，靶向治療已使某些亞型的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)受益，但由于繼發耐藥的產生，病死率仍很高。隨著腫瘤免疫治療的發展，免疫制劑PD1等正為肺癌患者帶來新的希望。Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)作為先天免疫中最重要的跨膜受體，參與誘導和調節免疫反應[1]。TLR3位于內體膜中，其被激活可刺激癌細胞凋亡并觸發炎性細胞因子的分泌，目前可作為咽、乳腺、卵巢、頭頸、前列腺、口腔等部位癌癥的治療靶點[2-8]。PolyI∶C作為TLR3的配體，可激活TLR3、PKR、RIG-1和MDA5，直接誘導癌細胞凋亡并破壞腫瘤微環境[9]。研究[10]證實，PolyI∶C單獨作用可誘導功能性TLR3蛋白低至中等水平表達的肺癌細胞的凋亡。本研究建立了小鼠NSCLC移植瘤模型，觀察PolyI∶C在小鼠體內的抗腫瘤活性，報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器DMEM、胎牛血清、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶(含0.25%EDTA)、PBS均購于美國Hyclone公司，PolyI∶C復合物(Ltd 20171101，規格3 g/L)購于北京信福醫藥科技有限公司，PD1(BE-0033-2-25MG，規格7.83 g/L)購于美國BioXcell公司，TUNEL試劑盒購于德國Roche公司，Thermo 細胞培養箱購于Thermo Scientific公司，低速離心機購于北京白洋儀器有限公司，倒置顯微鏡購于日本 OlymPus 公司。

1.2實驗分組4～6周齡雌性C57BL/6小鼠，SPF級，體重16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗前均在動物房適應1周，動物護理和所有實驗均經北京協和醫學院藥物研究所實驗動物倫理委員會批準。小鼠NSCLC細胞株LL/2由中國醫學科學院基礎醫學研究所提供，用胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次以去除殘存的胰蛋白酶及含血清培養液，用PBS配制成終密度為5×106個/mL的單細胞懸液。將小鼠隨機分為4組，滴鼻組、肌注組、陰性對照組和PD1組，每組6只，利用LL/2細胞，依文獻[11]方法制備小鼠NSCLC移植瘤模型。每2天用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑2×0.5。當腫瘤體積達到100 mm3時，開始分組處理。滴鼻組每隔1天PolyI∶C滴鼻1次(0.3 mg/次)，肌注組每隔1天肌內注射PolyI∶C 1次(0.3 mg/次)，PBS組每隔1天PBS滴鼻1次(100 μL/次)，PD1組腹腔注射以PBS稀釋為1 000 mg/L的PD1(100 μg/次，1周1次)。共用藥2周。

1.3觀察指標

1.3.1 抑瘤率 給藥處理后每2天用游標卡尺測量并計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。每2天使用電子天平測量小鼠體重并繪制體重變化曲線。用藥2周后將小鼠脫頸處死，剝離腫瘤組織稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=(腫瘤質量PBS組-腫瘤質量實驗組)/腫瘤質量PBS組×100%。

1.3.2 移植瘤組織中細胞凋亡的檢測 移植瘤稱重后于甲醛溶液中固定，4 μm厚切片，用TUNEL凋亡試劑盒檢測，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性細胞(即凋亡細胞)褐色著色。于200倍光學顯微鏡下選取5個代表性視野觀察并拍照，使用Image J軟件分析凋亡細胞百分比。

1.3.3 臟器轉移情況的觀察 處死小鼠時剝離肺、肝、腦等標本，用甲醛固定，進行HE染色，于40倍光學顯微鏡下選取5個代表性視野觀察，記錄各臟器轉移動物數。

1.4統計學處理使用SPSS 19.0行數據分析。4組小鼠體重、移植瘤體積的比較采用重復測量數據的方差分析；抑瘤率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1一般情況實驗期間各組小鼠均精神萎靡、活動減少、飲食較差，尤以PBS組表現最明顯，但無死亡。小鼠體重變化情況見表1。4組小鼠體重均逐漸增加，但從給藥第13天開始，肌注組小鼠體重增加幅度小于其他3組。

2.2 3組抑瘤率的比較移植瘤體積測定結果見表2。滴鼻組和肌注組移植瘤體積較PBS和PD1組減小(P<0.05)，而肌注組移植瘤體積較滴鼻組減小(P<0.05)。滴鼻組、肌注組和PD1組抑瘤率分別為(38.33±0.05)%、(50.39±0.03)%、(15.17±0.05)%，3組比較，差異有統計學意義(F=8.177,P=0.017);滴鼻組及肌注組抑瘤率較PD1組升高(P<0.05)，肌注組抑瘤率高于滴鼻組(P<0.05)。

表1 4組小鼠體重比較 g

F組間=30.576，F時間=54.698，F交互=8.659，P均<0.001

表2 4組移植瘤體積的比較 mm3

F組間=35.252，F時間=58.326,F交互=3.490，P均<0.001

2.3 4組移植瘤組織中細胞凋亡情況的比較PBS組、滴鼻組、肌注組及PD1組凋亡細胞百分比分別為(9.15±0.61)%、(12.33±0.61)%、(13.85±0.53)%和(11.39±1.02)%，4組比較，差異有統計學意義(F=30.119，P<0.001)；滴鼻組、肌注組及PD1組腫瘤細胞凋亡均增強(P<0.05)，且肌注組變化最為顯著。

2.4 4組各臟器轉移情況PBS組6只小鼠均發生肝、肺轉移；滴鼻組4只發生肝、肺轉移；PD1組發生肝轉移3只、肺轉移4只；肌注組6只小鼠均未發生臟器轉移。

3 討論

目前幾種TLR激動劑作為腫瘤疫苗或用于腫瘤的免疫治療而備受關注。PolyI∶C可被TLR3、RIG1、MDA5識別，誘導轉錄因子(如IRF3，IRF7和NF-kB等)的激活，促進Ⅰ型IFN的釋放，促進先天免疫的激活并長期促進T細胞免疫，因此作為潛在的抗腫瘤制劑具有重要意義。研究[12]表明，肺組織中TLR3的激活可以升高局部IL-5、IL-13和IgE水平，這與肺部Th2樣病變高度相關。但有研究[13]結果顯示，對注射mKSA細胞的小鼠重復給予PolyI∶C和腫瘤特異性抗原SV40，可誘導移植瘤的消退。

本研究中，我們將LL/2細胞種植到小鼠體內形成NSCLC移植瘤模型，觀察PolyI∶C單獨用藥的體內抗腫瘤效果。結果顯示，與PBS組比較，滴鼻組和PD1組小鼠體重變化無統計學意義，肌注組小鼠體重增加幅度大大減小；滴鼻組和肌注組移植瘤體積較PBS和PD1組減小，抑瘤率高于PD1組，且肌注組抑瘤率高于滴鼻組。滴鼻組、肌注組及PD1組移植瘤中腫瘤細胞凋亡較PBS組增強，且肌注組變化最為顯著。PBS組6只小鼠均發生肝、肺轉移；滴鼻組4只發生肝、肺轉移；PD1組發生肝轉移3只、肺轉移4只；肌注組6只小鼠均未發生臟器轉移。上述結果提示，PolyI∶C復合物在小鼠體內具有抗肺腫瘤活性，肌注給藥的效果好于滴鼻給藥，但副作用較大。

綜上所述，PolyI∶C復合物在小鼠體內具有顯著的抗腫瘤、抗轉移作用，但是其體內抗腫瘤作用的相關分子機制仍需進一步研究。