五苓散對糖尿病視網膜病變大鼠血-視網膜屏障的保護作用

陳 茜，王 菁，魏 偉

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，也是導致全球視力障礙和致盲的主要原因之一[1]。我國糖尿病高發，據統計患病人數已超過1億，有關DR的研究也成為相關領域的研究熱點[2]。DR早期病理變化是血-視網膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)結構及功能的破壞[3]。近年來，關于中醫藥防治DR的研究已取得重要進展，主要是通過改善血-視網膜屏障的通透性、視網膜水腫、血供等進行綜合治療，在臨床治療中被廣泛認可。五苓散是仲景名方，在《傷寒論》中五苓散原治蓄水證，涉及全身水液代謝問題，對于血-視網膜屏障通透性的變化，治宜利水滲濕為主，兼以溫陽化氣之法。長期臨床應用證實，五苓散對DR引起的血-視網膜屏障的破壞有較好的治療效果[4]。本研究通過構建糖尿病大鼠模型，觀察五苓散對模型大鼠視網膜血管滲透量的影響，初步探討五苓散對血-視網膜屏障的保護機制。

1材料和方法

1.1材料實驗動物：12周齡SPF級SD大鼠50只，雄性，購自南通大學實驗動物中心 [許可證號：SCXK(蘇)2014-0001]。主要試劑：五苓散(江蘇省中醫院)；康柏西普(朗沐)；鏈脲佐菌素(STZ)、伊文思藍(EB，美國Sigma公司)；大鼠可溶性細胞間黏附分子1 (sICAM-1)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(江蘇科晶生物科技有限公司)；大鼠C反應蛋白(CRP)ELISA試劑盒、兔抗鼠血管內皮生長因子(VEGF)抗體(武漢博士德公司)。主要儀器：酶標儀(2300，EnSpire)；微量進樣器(5μL，上海高鴿)；血糖儀(索萊寶)；石蠟切片機(RM2135，德國Leica)；組織脫水機(ASF30，德國Leica)。本研究經江蘇省中醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1動物分組及造模SD雄性大鼠50只適應性飼養1wk后，隨機分為空白組、模型組、高劑量組、低劑量組、陽性對照組，每組10只。模型組、高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠高脂高糖飼養2wk后，按照體質量腹腔注射STZ 50mg/kg，72h后尾靜脈取血，血糖≥16.7mmol/L、尿糖在+++以上者則認為糖尿病大鼠造模成功。空白組大鼠正常飲食飼養2wk后行等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。造模成功后，所有大鼠均正常攝食、飲水。

1.2.2藥物處理本研究所使用的五苓散由豬苓∶澤瀉∶白術∶茯苓∶桂枝=3∶3∶3∶3∶2組成，將藥物浸泡30min后煮沸1h，取出藥物，將藥物殘渣加入水后再煮沸1h，將兩次藥物混合后濃縮至生藥含量1g/mL的藥液。造模成功1mo后，按照大鼠正常劑量為人體的6.3倍計算，經換算高劑量組和低劑量組大鼠分別按0.74、1.5g/kg劑量灌胃給藥，1次/d，連續灌胃12wk。模型組和空白組大鼠采用等量生理鹽水灌胃。陽性對照組大鼠右眼球內使用微量進樣器注射康柏西普3μL[5]一次。所有處理過程均由固定科研人員完成。

1.2.3血糖和體質量監測分別于給藥0、2、4、6、8、10、12wk，測量每組大鼠的體質量和空腹血糖水平。

1.2.4ELISA法檢測大鼠血清sICAM-1和CRP的含量藥物處理12wk后，大鼠眼眶取血并收集血清。參考試劑盒說明書，將各組大鼠血清加入酶標板上，37℃培養箱中孵育30min，洗滌，加入酶標試劑，孵育，洗滌，每孔先后加入顯色劑A和B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min，加終止液50μL，450nm波長處測量各孔的吸光度值，根據標準曲線換算大鼠血清sICAM-1和CRP的含量。

1.2.5EB滲漏試驗觀察大鼠血-視網膜屏障通透性藥物處理12wk后，每組隨機選取4只大鼠麻醉后尾靜脈注射EB溶液45mg/kg，循環2h后處死大鼠，顯微鏡下取出右眼球并分離出視網膜，4℃過夜后晾干稱重，將大鼠視網膜與150μL甲酰胺于70℃孵育18h。低溫離心后取上清液，酶標儀測定620nm和740nm下樣品的吸光度(OD)值，并計算差值(凈吸光度值)，用視網膜干重(mg)標準化EB(ng)含量。每個樣品測量3次取平均值。

1.2.6HE染色觀察視網膜組織藥物處理12wk后，每組隨機選取3只大鼠麻醉處死，摘取右眼眼球，用10%甲醛固定、脫水、透明、浸蠟石蠟包埋，切厚度為4μm的切片。脫蠟后的視網膜經蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察視網膜各層結構并拍照。

1.2.7免疫組織化學染色法觀察視網膜VEGF表達藥物處理12wk后，每組隨機選取3只大鼠麻醉處死，視網膜石蠟切片制作方法同1.2.6。石蠟切片經PBS沖洗，3%過氧化氫37℃孵育5～10min以消除內源性過氧化物酶活性，室溫下蛋白封閉液封閉 5min，VEGF抗體(1∶200)4℃封閉過夜，加 HRP 標記的廣譜二抗，DAB顯色，蘇木精復染，封片。顯微鏡下觀察并采用 Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測定免疫組化視網膜組織累積光密度(integrated optical density，IOD)。

2結果

2.1五苓散對大鼠體質量和血糖水平的影響藥物處理前后，各組大鼠體質量和血糖水平比較，差異有統計學意義(體質量：F時間=143.953，P時間<0.001；F組間=210.282，P組間<0.001；F交互=280.769，P交互<0.001；血糖：F時間=3.583，P時間=0.007；F組間=939.474，P組間<0.001；F交互=2.783，P交互=0.003)。給藥0wk，模型組、高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠體質量、血糖水平與空白組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明造模成功。隨著時間的延長，模型組大鼠體質量呈下降趨勢，高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠體質量變化不明顯。給藥10、12wk，高劑量組大鼠體質量高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著時間的延長，模型組大鼠血糖水平無明顯變化。給藥10、12wk，高劑量組大鼠血糖水平低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1、2。

2.2各組大鼠血清sICAM-1和CRP的含量模型組大鼠血清sICAM-1和CRP含量均明顯高于空白組，高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠血清sICAM-1和CRP含量均顯著低于模型組，高劑量組大鼠血清sICAM-1和CRP含量均低于低劑量組和陽性對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。低劑量組大鼠血清sICAM-1和CRP含量高于陽性對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

圖1HE染色觀察各組大鼠視網膜組織(×400) A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽性對照組。

組別只數給藥0wk給藥2wk給藥4wk給藥6wk給藥8wk給藥10wk給藥12wk空白組10335.43±15.15375.45±18.40406.03±18.51434.83±17.45462.30±17.29493.59±23.71531.22±21.79模型組10266.11±19.56246.29±18.72235.36±18.16236.10±16.99225.81±16.49217.30±15.83216.03±17.48高劑量組10248.79±20.34232.88±19.26227.56±23.29233.78±21.83239.81±20.97247.62±6.06a248.58±23.36a低劑量組10250.54±19.92230.61±19.28224.56±23.24227.17±22.79232.79±21.80233.48±20.23237.01±18.67陽性對照組10246.86±17.72227.11±16.55221.14±21.59222.50±23.79222.61±21.91224.66±20.72228.51±17.48

注：aP<0.05vs模型組。

組別只數給藥0wk給藥2wk給藥4wk給藥6wk給藥8wk給藥10wk給藥12wk空白組105.76±0.415.79±0.555.71±0.465.59±0.525.17±0.565.16±0.395.54±0.33模型組1028.11±2.6128.56±1.9927.97±2.3228.10±2.0327.55±2.6128.00±2.3228.25±1.56高劑量組1029.34±2.5028.15±1.8027.54±2.1226.90±2.4425.99±1.6625.64±1.81a25.56±2.48a低劑量組1027.54±2.5226.75±1.8225.71±2.3427.67±1.6226.96±1.6327.00±1.2826.83±2.47陽性對照組1027.66±2.2727.06±2.5126.69±1.7927.01±1.9127.20±2.3327.4±1.6027.25±2.46

注：aP<0.05vs模型組。

組別只數ICAM-1(μg/g)CRP(ng/mL)空白組104.30±0.231.61±0.40模型組1014.33±0.225.30±0.32高劑量組1011.31±1.423.71±0.40低劑量組1011.94±1.544.13±0.16陽性對照組1011.84±1.614.05±0.24 F91.561230.78P<0.001<0.001

2.3大鼠血-視網膜屏障的通透性空白組、模型組、高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠視網膜組織EB滲透量分別為4.21±0.43、23.68±0.43、13.71±2.78、15.77±4.15、15.18±2.23ng/mg，差異有統計學意義(F=34.446，P<0.001)。模型組大鼠視網膜組織EB滲透量明顯高于空白組，高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠視網膜組織EB滲透量均較模型組減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。高劑量組大鼠視網膜組織EB滲透量低于低劑量組和陽性對照組，陽性對照組低于低劑量組，但差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.4大鼠視網膜組織病理學檢查結果空白組大鼠視網膜各層結構清晰，細胞形態正常，排列有序(圖1A)；模型組大鼠視網膜神經節細胞層排列紊亂，呈空泡樣，內、外核層水腫，出現空泡樣改變，可見血管樣結構(圖1B)；低劑量組大鼠視網膜神經節細胞見較小空泡，各層組織見輕度水腫，內、外核層細胞排列較疏松、紊亂，可見較大空泡(圖1C)；高劑量組大鼠視網膜各層結構和排列較清晰，水腫減輕，較模型組明顯改善(圖1D)；陽性對照組大鼠視網膜神經節細胞排列紊亂、水腫、溶解，外核層細胞間明顯水腫、排列疏松、紊亂(圖1E)。

2.5各組大鼠視網膜VEGF表達情況空白組大鼠視網膜中有少量VEGF表達；模型組大鼠視網膜各層均有VEGF表達，視網膜神經節細胞層、內叢狀層、內核層及色素上皮層呈深棕黃色；高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠視網膜VEGF表達下調，外核層可見(圖2)。空白組、模型組、高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠視網膜組織VEGF累積光密度值分別為146.2046±45.2672、1090.5060±131.2153、644.8474±36.4814、814.8597±26.5625、594.8474±27.3713，差異有統計學意義(F=81.163，P<0.001)。高劑量組、低劑量組、陽性對照組大鼠視網膜中VEGF表達量均低于模型組，高劑量組、陽性對照組大鼠視網膜中VEGF表達量均低于低劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)，陽性對照組大鼠視網膜中VEGF表達量低于高劑量組，但差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2免疫組織化學染色法觀察視網膜VEGF表達(×400) A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽性對照組。

3討論

迄今為止，對于DR的發病機制和代謝通路仍未闡明，炎癥反應對DR的發展起到關鍵作用[6]。機體在持續高糖狀態下，糖基化終末產物(AGEs)與其受體(RAGE)結合，激活核轉錄因子-κB(NF-κB)通道，使sICAM-1表達上調[7]。白細胞黏附于視網膜血管壁可導致血管通透性增強、內皮細胞損傷和毛細血管無灌注，故sICAM-1水平升高是DR最早的病理變化之一[8]。抑制sICAM-1的表達可以明顯降低白細胞瘀滯和BRB破壞[9]，延緩DR的進展。研究發現，VEGF表達增加，影響內皮緊密結合蛋白的功能，促使BRB的破壞，VEGF和炎癥因子之間的相互作用在DR和糖尿病性黃斑水腫(DME)的發病機制中具有重要的作用[10]。CRP是重要的炎癥標志物，是由炎性細胞因子白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子(TNF)刺激肝細胞和上皮細胞合成的一種全身性炎癥反應急性期的非特異性標志物，目前關于CRP與糖尿病關系的研究越來越受到關注[11]。Nalini等[12]發現在DR進展中，視網膜組織損傷可導致CRP水平升高，與糖尿病無視網膜病變患者比較，DR患者的炎癥因子(TNF-α、CRP)水平升高。此外，CRP可促進糖尿病患者體內長期持久的低度炎癥反應，進而導致血管內皮損傷，引起微血管病變[13]。

DR屬于中醫“消渴目病”范疇，主要病因病機為氣陰虧虛、脾腎兩虛，久致痰濕內生，脈絡瘀阻，目失濡養。消渴目病水濕內停導致氣滯血瘀，進而加劇DR的進展，使患者視力下降。目前，臨床中對于DR和靜脈阻塞引起的黃斑水腫的治療一般采用激光治療、玻璃體腔注射抗VEGF藥物和糖皮質激素治療等，均取得明顯的療效[14]。中醫認為，黃斑屬脾，水腫屬濕和水停，故辯證為脾腎陽虛、水濕內停、水濕上泛證。五苓散經驗方中重用澤瀉為君，直達腎與膀胱，利水滲濕。臣以茯苓、豬苓增強其利水滲濕之力。佐以白術健脾以運化水濕，桂枝通陽化氣，化氣布津。王琦認為五苓散并非專門利尿，更善于化氣布津，分消水氣，對于水蓄膀胱，水停體內一部分，水逆等均可發揮功效[15]。研究發現，五苓散穴位敷貼治療脾陽虧虛型痛風，治療1mo后，CRP顯著低于治療前[16]。

綜上所述，五苓散經驗方對大鼠體質量和血糖水平無明顯影響，雖然不能降低高血糖狀態，但是卻可以緩解體質量病態性下降。五苓散可以下調血清中炎癥因子(sICAM-1、CRP)的表達，降低視網膜組織中EB的滲透量，減輕視網膜水腫，改善血-視網膜屏障功能，抑制DR進展。但是，目前關于五苓散對DR的治療作用和機制尚處于初級階段，有待進一步的研究。