石斛酚對高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞的保護作用

張 梅，李春霞，韋 芳，秦 瑜

0引言

據世界衛生組織保守估計，至2035年糖尿病患病率將增加55%，由目前的3.82億增加至5.92億[1]。在過去1980/2010的30a中，經過7次全國性糖尿病調查，發現中國大陸糖尿病發病人群增長了17倍，且糖尿病和糖調節異常在中國已成為了流行病[2]。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病并發癥之一，在DR的發病過程中主要表現為視網膜血管病變和視網膜神經退行性病變，視網膜上所有細胞都會受到影響，并導致視功能逐漸喪失[3]。石斛是《中國藥典》歷版所收載的名貴中藥材，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功效，來源于蘭科石斛屬多種植物的新鮮或干燥莖?，F代研究發現石斛屬植物，具有抗腫瘤、免疫調節、抗血小板聚集、擴張血管、抗氧化、抗誘變等多種活性[4]，其主要化學成分為聯芐類、多糖、生物堿、菲類、芴酮、香豆素和倍半萜等化合物[5]。石斛酚是一種從石斛中提取出的聯芐類化合物，聯芐類化合物具有重要的抗腫瘤、抗誘變等生物活性，常被作為衡量石斛藥材質量的質控指標。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞及藥物人視網膜微血管內皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs，ACBRI181)購自Cell Systems(Kirkland，WA，USA)；石斛酚、依帕司他購自上海源葉生物科技有限公司。石斛酚結構式見圖1。

1.1.2試劑M199培養基、胎牛血清、2.5g/L胰蛋白酶、青-鏈霉素混合液購自Gibco公司；ROS活性氧檢測試劑盒購自凱基生物；一抗NF-κB(ab32536)購自Abcam公司，β-actin(60008-1-lg)購自Proteintech公司；二抗羊抗兔(111-035-003)購自Jackson公司；Trizol Reagent購自Invitrogen公司。

1.1.3儀器CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)，流式細胞儀(美國Beckman公司)，酶標儀(美國Thermo公司)，熒光定量PCR檢測儀(美國Thermo公司)，紫外分光光度計(上海司樂儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及處理使用含10%胎牛血清的M199低糖培養基(葡萄糖5.5mmol/L)，在37℃，5% CO2條件下培養細胞，每2～3d換液一次。實驗分為5組：正常組(葡萄糖5.5mmol/L，NG)、甘露醇組(葡萄糖5.5mmol/L+甘露醇24.5mmol/L，M)、高糖組(葡萄糖30mmol/L，HG)、石斛酚組(葡萄糖30mmol/L+石斛酚5μmol/L，GIG)、依帕司他組(葡萄糖30mmol/L+依帕司他1μmol/L，EPS)。實驗組細胞均培養48h。

1.2.2MTS實驗檢測細胞活力MTS細胞毒性與細胞增殖實驗試劑盒是用于測定細胞增殖與毒性實驗中活細胞數目的一種高靈敏度、無放射性的比色檢測法。HRMECs種植在96孔培養板中，每孔100μL，約1×104個細胞。將石斛酚及依帕司他在糖濃度為5.5mmol/L的培養基中設置出一系列濃度梯度組，每組設6個復孔，置37℃，5% CO2培養箱中孵育24h或48h。然后每孔加入20μL的MTS試劑，37℃孵育2h，用酶標儀在490nm波長處檢測每孔的光密度(OD)值。細胞活性=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.3ROS檢測活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測的試劑盒。HRMECs種植在6孔培養板中，置37℃，5% CO2培養箱中培養，待細胞達70%融合狀態后，將實驗分為正常組、甘露醇組、高糖組和石斛酚組4組，孵育48h，然后去除培養基，在避光條件下用無血清培養基按照1∶1000稀釋DCFH-DA，每孔不少于1mL，置于37℃孵育30min。收集細胞，用PBS清洗3次，將細胞重懸于300μL預冷的PBS中，送流式細胞儀，使用488nm激發波長，525nm發射波長檢測細胞ROS的活性。

圖1石斛酚化學結構式。

1.2.4qRT-PCR檢測mRNA的表達各組細胞處理結束后，采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計測D260/280的值，估算RNA的純度，并測RNA濃度，計算RNA含量，將其逆轉為cDNA，在熒光定量PCR儀上進行實時定量PCR檢測醛糖還原酶(aldose reductase，AR)、缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的基因表達情況。引物序列：AR前鏈：GTC CAA AGG CAT CGT GGT GA；后鏈：AGC AAT GCG TTC TGG TGT CA；HIF-1α前鏈：TGC TTG GTG CTG ATT TGT GA；后鏈：GGT CAG ATG ATC AGA GTC CA; VEGF 前鏈：AAG GAG GAG GGC AGA ATC AT；后鏈：ATC TGC ATG GTG ATG TTG GA；β-actin前鏈：GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG；后鏈：AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG。反應條件：預變性(95℃ 30s)，PCR反應(95℃ 5s，60℃ 34s，40個循環)，溶解曲線(95℃ 15s，60℃ 60s, 95℃ 15s)。結果處理：△Ct=Ct目的基因- Ct內參基因，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對照組，以 2-△△Ct值作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.2.5Westernblotting檢測相關蛋白的表達檢測核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的蛋白表達，正常組、甘露醇組、高糖組、石斛酚組、依帕司他組細胞處理結束后，用PBS洗3次，RIPA裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。定量20μg上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳100mV恒壓，70mV恒壓轉模，封閉，加一抗NF-κB(1∶5000)，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，再加辣根過氧化物酶標記的二抗IgG室溫孵育。TBST洗膜后ECL顯影曝光。用Image J軟件分析，并計算各組光密度與β-actin光密度的比值，分析蛋白的相對表達水平。

1.2.6細胞劃痕實驗細胞劃痕實驗是一種檢測細胞遷移與修復能力的實驗。HRMECs種植在12孔培養板中，待細胞達90%融合狀態后，在每孔中均勻地劃出十字空隙，分為正常組、甘露醇組、高糖組和石斛酚組4組，置37℃，5% CO2培養箱中孵育48h。在倒置顯微鏡下分別在藥物開始處理后的0、24、48h拍照，用Image J軟件統計細胞遷移面積，并計算細胞的愈合率，愈合率=(處理后面積-0h面積)/0h面積×100%。

圖2石斛酚對細胞活性的影響A：不同濃度石斛酚作用于細胞24h；B：0～20μmol/L的石斛酚作用于細胞48h；C：0～10μmol/L的依帕司他作用于細胞48h。aP<0.05vs對照組。

圖3高糖誘導內皮細胞發生氧化應激反應A：流式儀檢測各實驗組ROS的表達活性；B：各實驗組ROS的平均熒光強度，aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs高糖組。

2結果

2.1石斛酚對細胞活性的影響MTS實驗結果見圖2A顯示，一系列濃度梯度的石斛酚作用于HRMECs 24h，各組細胞活性差異無統計學意義(F=0.860，P=0.574)。選取0～20μmol/L石斛酚孵育細胞48h，結果見圖2B，各組細胞活性差異有統計學意義(F=5.321，P=0.015)。20μmol/L石斛酚組與對照組比較，20μmol/L石斛酚組細胞活性明顯下降，差異有統計學意義(t=3.959，P=0.003)；1～10μmol/L石斛酚組與對照組比較，5μmol/L石斛酚組細胞活性最高，其活性與對照組差異無統計學意義(t=0.135，P=0.895)。依帕司他孵育HRMECs 48h，MTS實驗結果見圖2C，各組細胞活性差異有統計學意義(F=13.225，P=0.002)，10μmol/L依帕司他組與對照組比較，10μmol/L依帕司他組細胞活性明顯下降，差異有統計學意義(t=0.587，P<0.001)，0.1～1μmol/L依帕司他組與對照組比較，1μmol/L依帕司他組細胞活性最高，其活性與對照組差異無統計學意義(t=0.096，P=0.366)。

2.2石斛酚對氧化應激的影響各組ROS的熒光強度分布，差異有統計學意義(F=233.844，P<0.001)。高糖組與正常組比較，高糖組ROS明顯升高，差異有統計學意義(t=23.888，P<0.001)；石斛酚組與高糖組比較，石斛酚組ROS明顯降低，差異有統計學意義(t=5.342，P<0.001)。甘露醇組與正常組比較，差異無統計學意義(t=0.131,P=0.898),見圖3。

2.3石斛酚對AR/NF-κB的調控圖4A是AR在5組實驗組中的mRNA表達結果，各組AR mRNA表達差異有統計學意義(F=4.459，P=0.025)，高糖組與正常組比較，高糖組AR表達升高，差異有統計學意義(t=3.596，P=0.005)；石斛酚組、依帕司他組與高糖組比較，石斛酚組與依帕司他組表達下降，差異有統計學意義(石斛酚組：t=3.178，P=0.01；依帕司他組：t=3.369，P=0.007)。圖4B、C是5組Western blotting結果，各組NF-κB蛋白表達差異有統計學意義(F=25.220，P<0.001)，高糖組與正常組比較，高糖組NF-κB表達升高，差異有統計學意義(t=6.916，P<0.001)；石斛酚組、依帕司他組與高糖組比較，石斛酚與依帕司他組表達下降，差異有統計學意義(石斛酚組：t=8.503，P<0.001；依帕司他組：t=7.483，P<0.001)。甘露醇組與正常組比較，差異無統計學意義(AR表達t=0.495，P=0.631；NF-κB表達t=1.417，P=0.187)。

2.4石斛酚對HIF-1α和VEGF的調控圖5顯示的是石斛酚對細胞中HIF-1α和VEGF的mRNA表達的調節作用，各實驗組HIF-1α和VEGF的mRNA表達差異都有統計學意義(HIF-1α表達：F=4.263，P=0.029；VEGF表達：F=39.936，P<0.05)。高糖組與正常組比較，高糖組HIF-1α和VEGF的表達都明顯升高，差異有統計學意義(HIF-1α表達：t=3.112，P=0.011；VEGF表達：t=9.877，P<0.05)；石斛酚組與高糖組比較，石斛酚組HIF-1α和VEGF的表達都明顯降低，差異有統計學意義(HIF-1α表達：t=3.801，P=0.003，VEGF表達：t=8.051，P<0.05)，甘露醇組與正常組比較，差異無統計學意義(HIF-1α表達：t=0.443，P=0.667；VEGF表達：t=1.405，P=0.198)。

圖4石斛酚對高糖誘導的AR/NF-κB的調控A：AR mRNA的表達水平；B：Western blotting法檢測高糖下內皮細胞中NF-κB蛋白表達水平；C：NF-κB蛋白的相對表達水平，aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs高糖組。

圖5采用實時定量PCR檢測HIF-1α和VEGFmRNA的表達A：HIF-1α mRNA的表達；B：VEGF mRNA的表達。aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs高糖組。

圖6石斛酚對細胞遷移能力的影響A：倒置顯微鏡下觀察細胞遷移能力(×100)；B：24、48h各組細胞愈合率比較，aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs高糖組。

2.5石斛酚對細胞遷移的影響為探究石斛酚對細胞運動能力的影響，用細胞的愈合率反映其遷移能力。圖6A是各實驗組細胞在藥物作用后0、24、48h的位置，可看到隨著時間的延長，各組細胞也在生長，但生長的速度不同。圖5B是對各組細胞的愈合率進行統計分析，發現各實驗組的愈合率差異有統計學意義(24h：F=15.926，P=0.001；48h：F=5.493，P=0.024)。高糖組細胞在24h和48h時間內生長都是快于正常組的，但只有24h時，差異有統計學意義(24h：t=5.374，P=0.001；48h：t=2.136，P=0.065)。且石斛酚組細胞在24h和48h時間內生長都明顯慢于高糖組，差異有統計學意義(24h：t=4.337，P=0.002；48h：t=3.006，P=0.017)。甘露醇組與正常組在24h和48h比較，差異無統計學意義(24h：t=1.054，P=0.323；48h：t=1.724，P=0.123)。

3討論

代謝異常致血糖升高，而ROS累積會產生氧化應激反應，進而損害視網膜血管，最終發展為DR。據研究，高糖血癥損害血管主要通過四條經典途徑：(1)多元醇代謝途徑；(2)晚期糖基化終末產物途徑；(3)蛋白激酶C的激活途徑；(4)氨基己糖的激活途徑。這些途徑都與ROS的過度產生有關，而DR會誘導ROS生成。氧化應激能激活相關細胞信號分子，從而增加基因表達和改變酶的功能，導致視網膜功能受損，如內皮細胞功能異常、周細胞凋亡、血視網膜屏障功能受損、滲透性過高、黃斑水腫、異常新生血管等表現[6-7]。

多元醇通路在DR的發展中起重要作用，而AR是多元醇通路的關鍵限速酶。AR廣泛存在于腎臟、血管、晶狀體、視網膜、心臟、骨骼肌等組織器官中，催化葡萄糖轉化為不易通透細胞膜的山梨醇，使細胞腫脹、變性、壞死，與糖尿病慢性并發癥的發生發展有密切關系[8]。研究發現，石斛酚可作用于AR。石斛酚能延遲晶狀體混濁，保持晶狀體的透明度，具有抗滲透壓和抗氧化的能力，在糖尿病性白內障的治療中起重要作用[9]。此外，石斛酚可抑制NF-κB通路，減少RAW264.7巨噬細胞中由脂多糖誘導的誘導型一氧化氮合酶和環氧化酶-2的產生[10]。

本研究用30mmol/L葡萄糖建立高糖模型，模擬DR在體內的發病過程。為防止高滲環境對內皮細胞產生影響，特設置甘露醇組，保持與高糖組相同的滲透壓環境。石斛酚作為一種從傳統中草藥石斛中提取的單體，已被證實可作用于AR，但是未在DR中做過有關視網膜微血管內皮細胞的研究。本實驗使用HRMECs，可能在病理特征方面更加貼近DR的實際病理變化，便于得出更為接近臨床的實際研究結果。有研究發現，依帕司他作為一種醛糖還原酶抑制劑，能通過多元醇通路減少2型糖尿病患者紅細胞中某些氧化應激標志物，達到治療糖尿病及其并發癥的目的[11]。本實驗中使用石斛酚作用于高糖環境下的細胞，依帕司他作為陽性對照，擬探究石斛酚在DR中是否可以像在糖尿病性白內障中一樣，通過抑制AR發揮作用。本研究發現，與高糖組相比，石斛酚與依帕司他都可減少HRMECs中AR mRNA的表達，NF-κB的蛋白表達量也呈下降趨勢。實驗結果說明石斛酚可能會通過抑制AR/NF-κB通路起到治療DR的作用。此外，所有實驗結果都顯示，甘露醇組與正常組比較，差異無統計學意義，說明30mmol/L的高滲狀態并未對內皮細胞產生不良影響。

DR是最常見的視網膜血管病，微血管細胞受損導致視網膜缺血缺氧，從而產生新生血管，HIF-1α是新生血管形成過程中的關鍵因子[12]。HIF-1α作為缺氧反應中的一個調節因子，在臨床上尚未發現眼內有明顯缺血改變前，視網膜上HIF-1α的表達已增加，HIF-1α表達越多表明視網膜缺血缺氧的情況越嚴重[13]。HIF-1α可誘導VEGF激活，而VEGF與新生血管的形成有重要關系。實驗證明，削弱氧化應激中ROS的產生，可抑制HIF-1α/VEGF 通路激活，從而減少新生血管生成[14]。本研究中熒光探針DCFH-DA結果顯示，石斛酚可明顯減少HRMECs中ROS的表達，同時其下游的HIF-1α/VEGF通路表達也受到抑制，HIF-1α和VEGF的mRNA表達明顯降低，說明石斛酚可改善高糖環境下視網膜缺血缺氧的狀態，在對抗氧化應激反應方面有顯著效果，并且可能有助于減少DR中新生血管的形成。

綜上所述，本研究通過探討石斛酚對高糖誘導的HRMECs中AR通路和氧化應激的作用機制，發現石斛酚能抑制HRMECs中的AR通路和氧化應激反應，并能對抗VEGF的表達，減少新生血管形成，為臨床治療DR提供了重要的理論依據，但是要將實驗結果轉為臨床成果還需進一步的研究。